过去的几十年里，研究人员大多采用细胞群体进行生物学研究，但由于细胞之间存在异质性，基于细胞群体的研究已不能再满足科研的需求。

作为单细胞测序的一个重要里程碑，10X Genomics Chromium™实现了真正意义上的单个细胞测序。目前，10X Genomics单细胞转录组测序已广泛应用于肿瘤细胞异质性、免疫细胞群体检测以及胚胎发育等研究。

今天就为大家介绍下10X Genomics单细胞转录组测序。
 

技术原理

10X Genomics的Chromium系统利用8通道的微流体“双十字”交叉系统，将含barcode的凝胶珠（Gel Beads）、细胞和酶的混合物、油三者混合，形成GEMs（油包水的微体系）。GEMs形成后，细胞裂解，凝胶珠自动溶解释放大量barcode序列，随后mRNA逆转录产生带有10X barcode和UMI信息的cDNA，构建标准测序文库，其中10X barcode用于区分细胞，UMI用于区分mRNA分子。
 

建库流程

（1）凝胶珠进入第一个进样口与细胞悬液和酶等混合，通过第二个进样口时被油滴包裹，形成GEMs，随后细胞裂解，凝胶珠溶解，进行逆转录；

（2）油滴破裂，收集cDNA产物，进行cDNA扩增；

（3）构建测序文库进行测序。

 

样本准备

欧易提供携带10X Genomics上门建库服务，由于10X Genomics对样本要求较高，老师需注意以下几点样本要求：

（1）细胞数量：一个样品细胞起始量大于1x10⁵个；

（2）细胞浓度：5x10⁵-1.2x10⁶ /ml，最低需要1x10⁵ml；

（3）细胞活性：活细胞数量在90%以上；

（4）细胞大小：直径小于40 μm；

（5）细胞培养基及缓冲液不能含有Ca ²⁺和Mg ²⁺等影响酶活性的物质；

（6）组织需解离成单细胞悬液，植物细胞需制成原生质体。

 

常见问题

为什么每个样品需要那么多的细胞量？

答：细胞在上机之前，需要对进行一系列的质检，质检过程需要使用部分细胞。

 

 为什么对细胞活性有要求？

答：死细胞中的降解的RNA片段会混进GEMs中，影响测序结果。

 

 如何检测细胞活性？

答：可以使用台盼蓝染色，用显微镜观察计数。

 

为什么对细胞大小有要求？

答：由于凝胶珠和油滴的大小是一定的，细胞过大会影响油包水微体系的结合。

 

为什么细胞培养基及缓冲液不能含有Ca ²⁺和Mg ²⁺等影响酶活性的物质？

答：Ca ²⁺和Mg ²⁺等会影响酶活性从而影响到cDNA的生成。

 

10X genomics单细胞转录组测序需要测多少数据量？

答：根据10X genomics官方的Single Cell 3' v2试剂盒，最低每个细胞测50K reads。