前 言

ceRNA (Competing endogenous RNA, 内源竞争性 RNA)，通常指 mRNA、lncRNA、circRNA 等 RNA 分子，竞争性结合 miRNA 的作用方式。当 miRNA 被 lncRNA 或 circRNA 竞争性结合时，受 miRNA 调控的 mRNA 转录水平会上升。

那么 ceRNA 研究应该如何开展？

2019 年 1 月 7 日，同济大学附属第十人民医院张春林教授课题组，在 Molecular Therapy (IF: 7.008) 上报道了有关骨肉瘤化疗抗性过程中的 ceRNA 调控网络。

一起来学习一下。

 

基本信息

论文题目：Analyzing the interactions of mRNAs, miRNAs, lncRNAs and circRNAs to predict competing endogenous RNA networks in osteosarcoma chemo-resistance

发表期刊：Molecular Therapy

影响因子：7.008

作者单位：同济大学附属第十人民医院张春林教授课题组

本文中所涉及的全转录组测序、small RNA 测序由欧易生物提供服务

 

研究背景

骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤，具有转移性高的特点。化疗是骨肉瘤的有效治疗手段，但化疗抗性严重影响病人的预后。因此有必要对骨肉瘤化疗抗性的分子机制进行深入研究。非编码 RNA 在肿瘤的增殖、侵袭、转移和化疗抗性中的作用具有广泛报道，特别是以 ceRNA 作用机制的转录后调控方式。本项目通过全转录组测序和 small RNA 测序，旨在对骨肉瘤化疗抗性中 ceRNA 调控网络进行研究。

 

研究内容

通过对化疗抗性 vs 化疗敏感的骨肉瘤细胞系进行全转录组测序和 small RNA测序，筛选到一系列差异表达的 lncRNA、circRNA、mRNA 和 miRNA，构建了 ceRNA 调控网络。并通过 RT-pCR、RIP、RNA pull down、双荧光报告系统等手段，对其中的两个 ceRNA 网络（lncRNAMEG3/hsa-miR-200b-3p/AKT2 和 hsa_circ_0001258/hsa-miR-744-3p/GSTM2）进行了验证。

 

研究路线

 

研究结果

1. 通过全转录组测序和 small RNA 测序，对比 3 个化疗抗性和化疗敏感的配对细胞系，共鉴别到差异 lncRNA 339 个、差异 circRNA 80 个、差异 mRNA 2606 个、差异 miRNA 21 个。

图 | 差异 lncRNA、circRNA、miRNA 和 mRNA 的火山图与 heatmap 图

 

2. 对差异的 RNA，分别构建 lncRNA-miRNA-mRNA、circRNA-miRNA-mRNA 调控网络，然后对其中的 mRNA 分别进行 GO 和 KEGG 富集分析。结果如下图：

3. 根据所富集到的通路，筛选与药物抗性相关的 mRNA，特别是同时参与多个药物抗性 pathway 的 mRNA，并利用这些 mRNA 参与 ceRNA 构建。11 个 mRNA、61 个 lncRNA 和 101 个 miRNA 参与构建了 1269 个 lncRNA-miRNA-mRNA pathway，10 个 mRNA、9 个 circRNA 和 37 个 miRNA 参与构建了 90 个 circRNA-miRNA-mRNA pathway。其中，有 8 个 circRNA 和 11 个 lncRNA 具有相同的靶 miRNA 和 mRNA。

4. 对上述的 ceRNA 网络，随机选择 lncRNA MEG3/hsa-miR-200b-3p/AKT2 pathway 进行验证：1) RNAseq 数据显示 MEG3 和 AKT2 表达量在化疗抗性细胞系和临床组织中均出现上调，而 hsa-miR-200b-3p 表达量显著下调；2) 采用 RNAi 干扰 MEG3 表达后，AKT2 基因的 mRNA 和蛋白质表达水平均出现下调，并且 AKT2 下调可以被 hsa-miR-200b-3p inhibitor 所挽救；3) 分别构建包含 wild-type 和 mutant-type 的 MEG3 3’-UTR 的荧光素酶报告载体，结果显示 wild-type 的载体和 miR-200b-3p mimics 共转出现荧光信号下降；4) 分别进行 RIP 和 pull down，结果显示 MEG3 可以和 miR-200b-3p 直接结合；5) 同样利用荧光素酶系统，显示 miR-200b-3p 也可以和 mRNA AKT2 直接结合。

5. 对上述的 ceRNA 网络，随机选择 hsa_circ_0001258/has-miR-744-3p/GSTM2 pathway 进行验证：1) 在化疗抗性细胞系和临床组织中，hsa_circ_0001258 和 GSTM2 表达量下降，miR-744-3p 表达量上升；2) 转染 hsa_circ_0001258 过表达载体，GSTM2 mRNA 表达量显著上升；3) 转染 miR-744-3p inhibitor 后，GSTM2 mRNA 和 hsa_circ_0001258 表达量显著上升；4) 荧光素酶报告系统显示，hsa_circ_0001258 可以和 miR-774-3p 结合，miR-774-3p 可以结合到 AKT2 3’-UTR 位置。

 

研究结论

本研究是首篇系统性研究软骨瘤化疗抗性中 lncRNA、circRNA、miRNA、mRNA 变化的文章，构建并验证了其中的 lncRNA-miRNA-mRNA 和 circRNA-miRNA-mRNA ceRNA 网络。本研究对于揭示软骨瘤化疗抗性的分子机制及寻找新的治疗靶点奠定了基础。

 

参考文献

Zhu KP, Zhang CL, Ma XL, et al. Analyzing the interactions of mRNAs, miRNAs, lncRNAs and circRNAs to predict competing endogenous RNA networks in osteosarcoma chemo-resistance. Mol Ther 2019; doi: 10.1016/j.ymthe.2019.01.001.