欧易生物单细胞测序近期高分文章不断，在接下来的几篇单细胞文献解读软文里，我们将为大家持续送上近期合作发表的单细胞文献解读。本篇文章为大家解读今年5月由上海交通大学附属上海市第一人民医院刘堃团队在Diabetes (IF 9.461) 期刊发表的关于2型糖尿病小鼠视网膜组织的分子图谱和异质性的相关成果。

 

 基本信息 

材料：3只2型糖尿病模型小鼠 (db/db)；3只对照小鼠 (db/m) 的视网膜组织

期刊：Diabetes

发表时间：2021年5月

方法：欧易生物10x Genomics scRNA-seq

 

研究背景和研究目的

糖尿病视网膜病变 (DR) 是导致中年人获得性失明的主要原因，而现有的治疗只针对伴有视力损害的晚期DR，因此迫切需要预防和早期治疗方针。鉴于视网膜错综复杂的细胞结构，DR的复杂病理很难解剖。本研究期望通过单细胞测序 (scRNA-seq) 技术全面解析DR视网膜组织分子图谱特征，阐明介导DR发病的主要因素。

 

研究内容概述

对3只对照小鼠 (db/ m) 和3只2型糖尿病模型小鼠 (db/db) 的视网膜组织进行单细胞转录组测序，分别获得34,010和51,558个视网膜细胞用于后续分析，共鉴定为11种细胞类型。随后，通过基于全基因组关联研究 (GWAS) 的富集分析和差异分析确定了几个可能在疾病过程中作用更大的细胞群。此外，作者还系统地描绘了糖尿病和对照小鼠的视网膜细胞间通讯网络。作者分析了db/db和db/m小鼠各细胞类型间的差异基因，并推测RLBP1基因可以作为DR的治疗靶点，随后利用实验验证了其在穆勒神经胶质细胞中过表达能够缓解DR相关的神经血管变性。

 

具体研究内容解析

1. 视网膜细胞类型的鉴定

Figure 1. 视网膜细胞群和易受DR影响的视网膜细胞的测定

 

首先对样本细胞经过质控后，分别获得对照组/糖尿病小鼠的34,010/51,558个视网膜细胞用于后续分析。基于已有的marker基因，作者共将17个cluster鉴定为11个细胞类型 (Figure 1A-1C)，包括视杆细胞、视锥双极细胞、视杆双极细胞、穆勒神经胶质细胞、无长突细胞、视网膜神经节细胞、视锥细胞、小胶质细胞、血管内皮细胞、周细胞和水平细胞。此外，作者比较了糖尿病小鼠和对照组小鼠视网膜中各细胞群细胞数的占比情况 (Figure 1D)，该分析有助于筛选出易受DR影响的细胞类型。

 

2. DR相关风险位点的细胞类型的特异性表达

Figure 2. DR和PDR (增殖性DR) 相关风险位点的细胞类型特异性表达

 

为了揭示已鉴定的细胞群与DR和PDR之间的潜在联系，作者利用GWAS分析获得与DR和PDR相关的风险位点，并在db/m和db/db小鼠视网膜细胞群中分析其差异表达水平 (Figure 2A-B)。结果发现视杆细胞、视杆双极细胞、视锥细胞和血管内皮细胞与PDR风险关系最密切。此外，在穆勒神经胶质细胞中，cluster6细胞群与db/ m和db/db小鼠之间视网膜的变化关系更密切，表明它们可能在疾病过程中发挥更大的作用。

 

3. DR改变了视网膜细胞间的通讯

Figure 3. db/m和db/db小鼠视网膜细胞间通讯的改变

 

基于受体配体分析，作者分别构建了db/m和db/db小鼠的视网膜细胞间的通讯网络 (Figure 3A)，结果发现两组样本的视网膜神经节细胞、血管内皮细胞和穆勒神经胶质细胞的受体配体表达活性最高。此外，与db/m小鼠相比，db/db小鼠视网膜小胶质细胞的受体配体表达活性增高，而其他细胞类型表达活性降低。

 

此外，在db/m和db/db小鼠之间，特异性受体配体的相互作用也发生了改变。作者假设细胞类型比例的变化可以通过参与细胞间相互作用的基因的变化来解释。为了验证这一点，作者检测了每个受体配体对所在的细胞亚群：配体在一个细胞亚群中的表达水平是否与表达其受体的细胞亚群的比例相关（包括自分泌通讯）。例如，糖尿病期间视网膜神经节细胞、视杆细胞和视锥细胞上调VEGFA与穆勒神经胶质细胞比例的下降相关，穆勒神经胶质细胞表达其受体VEGFR2，该受体由kdr编码 (Figure 3B)。此外，表达ephb1的穆勒神经胶质细胞的比例与视网膜神经节细胞表达的efnb3相关 (Figure 3B)。

 

4. DR致病性相关基因的鉴定

Figure 4. DR相关基因鉴定

 

与一般转录组测序相比，作者使用scRNA-seq进行基因表达分析，希望通过各细胞类型的基因组信息阐明可能隐藏在整体组织分析中的DR病理机制。为了识别可能导致DR发病的特异性基因，作者检测了每一种细胞类型中db/db和db/m小鼠视网膜细胞之间上下调top 25的差异基因 (Figure 4)。

 

Figure 5. 视网膜各细胞类型的特异性差异基因

 

结果表明，与对照组相比，fos、madd和pttg1在多种细胞类型中均高表达 (Figure 5A)。糖尿病小鼠中编码CRALBP的RLBP1基因在穆勒神经胶质细胞中的表达量降低，但在其他几种视网膜细胞类型中表达量升高。除了这些相对普遍的差异表达基因外，不同细胞类型之间特异性差异表达基因还可以作为DR的选择性治疗靶点，缓解DR特异性病理异常 (Figure 5B)。

 

5. 过表达RLBP1减轻了糖尿病导致的视网膜神经血管病变

Figure 6. RLBP1可缓解糖尿病性视网膜神经血管疾病

 

靶向视网膜差异基因可以使多种视网膜细胞类型正常化，从而提供更全面、更有效的治疗手段。在糖尿病影响的多种细胞类型中发现了一些差异表达基因，包括RLBP1，其目前已在常染色体隐性视网膜疾病中得到广泛研究。人类RLBP1突变可导致白点状视网膜变性、视锥视杆营养不良和常染色体隐性视网膜色素变性等。然而，人们对其在DR中的作用知之甚少，这可能是因为一般转录组测序无法分析RLBP1在各细胞类型中的变化。作者通过单细胞转录组测序技术，发现RLBP1在DR穆勒神经胶质细胞中表达量下调，而在其他视网膜细胞类型中上调。

 

因此，作者假设穆勒神经胶质细胞中上调RLBP1表达可以作为缓解DR神经血管变性的靶点。为了验证该结论，作者首先通过免疫荧光染色和Western blotting证实了CRALBP在糖尿病视网膜组织中的显著下调 （Figure 6A-B）。并验证了在玻璃体腔内注射AAV-ShH10Y能够有效地将转基因传递到穆勒神经胶质细胞 (Figure 6C)，随后利用AAV载体在db/db小鼠的穆勒神经胶质细胞中特异性表达RLBP1 (在db/db小鼠玻璃体中注射PBS缓冲液作为对照)，并记录所有四组小鼠的空腹体重和血糖水平，从而研究RLBP1过表达是否会导致胶质功能障碍和促炎细胞因子的诱导。接下来作者用胶质标志物GFAP评估胶质反应，如图6D所示，在db/m小鼠的视网膜中，星形胶质细胞和穆勒神经胶质细胞末梢的GFAP表达受限。然而，在未处理的db/db小鼠中，在穆勒神经胶质细胞中检测到GFAP的表达，表明其胶质功能损伤 (Figure 6D)。而在db/db小鼠体内注射ShH10Y后，星形胶质细胞和穆勒神经胶质细胞中显示GFAP的上调降低 (Figure 6D)，结果说明RLBP1过表达能够缓解胶质功能障碍。

 

此外，分析结果显示，糖尿病导致促炎细胞因子IL-1β和TNF-α表达量增加，而在db/db小鼠中，过表达RLBP1却导致这些细胞因子表达量降低 (Figure 6E)。与db/m小鼠相比，db/db小鼠视网膜中的TUNEL阳性细胞数量显著增加，表明其DNA链断裂 (Figure 6F)。而与注射PBS的db/db小鼠相比，注射了ShH10Y.RLBP1的 db/db小鼠视网膜中TUNEL阳性细胞数量明显减少。在评估神经元功能障碍时，视网膜神经节细胞特异性marker Brn3显示，与db/m小鼠相比，未处理db/db小鼠的视网膜神经节细胞显著减少；而与注射PBS的db/db小鼠相比，注射了ShH10Y.RLBP1的 db/db小鼠视网膜中神经节细胞显示增加。此外作者还检测了四组小鼠的α和β波振幅的大小，结果显示，过表达RLBP1显著降低了α和β波振幅的衰减。接下来，作者通过检查无细胞毛细血管来评估RLBP1对DR血管病变的影响。与预期结果一样，相比于db/m小鼠，注射PBS的db/db小鼠的视网膜无细胞毛细血管数量显著增加， 而与注射PBS的db/db小鼠相比，注射ShH10Y.RLBP1的db/db小鼠视网膜无细胞毛细血管数量显著减少。之后，使用伊文思蓝染色来确定血-视网膜屏障 (BRB) 的通透性程度。结果显示，RLBP1过表达的db/db小鼠的血管通透性显著降低，表明RLBP1过表达能够缓解糖尿病性视网膜神经血管疾病。总结来说这些数据提供了糖尿病和正常情况下视网膜的详细分析，提供了可能靶向治疗DR和相关功能障碍的致病因素的新见解。

 

 欧易点评 

本篇文章是典型的单细胞图谱形式文章，文章最主要的亮点是GWAS分析发现DR、PDR相关风险位点以及利用实验验证了基因功能。在分析手段上，本篇文章尤其在GWAS分析和细胞通讯分析的运用上具有很好的参考意义。

 

 参考文献 

Niu T , Fang J , Shi X , et al. Pathogenesis Study Based on High-Throughput Single-Cell Sequencing Analysis Reveals Novel Transcriptional Landscape and Heterogeneity of Retinal Cells in Type 2 Diabetic Mice[J]. Diabetes, 2021.

 

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