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一文带你解锁新技术—CUT&Tag技术

人阅读 发布时间:2021-10-09 16:44

一、 简介 

 

CUT&Tag是蛋白质-DNA互作关系研究的新方法,2019年弗雷德哈钦森癌症研究中心的Henikoff博士在Nature Communication公开了该技术的详细结果与实验方案。与以往的ChIP-Seq、pA-MNase等方法相比,这种技术方法简便易行,信噪比高,重复性好,需要的细胞数量少至60个细胞,且有望将ChIP-Seq做到单细胞水平。

 

本文将就近期发表在Genome Research上的一篇文章为例介绍本技术的一个应用场景。

 

与我们以往的经验不同,本文的研究对象不是组蛋白,也不是转录因子,而是G-四链体(G4)。

 

G-四链体(G4s)是通过鸟嘌呤自结合形成的非规范DNA二级结构,是一种暂时性结构,大量存在于即将分裂的细胞中,可参与多种生物过程,包括基因转录、DNA复制、基因组不稳定性以及端粒延长和维持(Varshney et al.2020)。基因转录是染色质松弛和单链DNA(ssDNA)暴露的驱动力,这是G4形成的先决条件。2020年8月有研究表明G-四链体的丰度和位置在癌症中有重要作用,可以作为开发诊疗方法,对抗乳腺癌的重要潜在靶点。另外也有研究表明,每种乳腺癌亚型都有不同的G-四链体模式或“景观”。确定肿瘤中G-四链体的特殊模式,有助于查明乳腺癌亚型,从而提供更具针对性的精准治疗。然而,关于G4s在转录调控中的确切作用的全基因组研究仍然缺乏。

 

本文建立了一种敏感的G4-CUT&Tag方法,用于高分辨率和特异性的天然G4s全基因组分析。

 

 

二 、材料与方法 

 

1. 材料

(1)HEK293T细胞

(2)带有His-tag的Flag-BG4抗体

2.方法:见图1

图1 CUT&Tag实验流程

 

 

三 、实验结果 

 

1. G4-CUT&Tag技术的信噪比及分辨率高于ChIP-seq技术

与G4 ChIP-seq相比,G4-CUT&Tag在启动子区域产生的信号更高,背景信号更少(图2)分辨率更高(图3)

 

图2 G4-CUT&Tag数据背景信号低


图3 G4-CUT&Tag分辨率高

         

2. G4-CUT&Tag技术生物学重复性高

生物学重复之间的高度相关性说明G4-CUT&Tag的再现性比较高(图4)研究发现G4-CUT&Tag和G4 ChIP-seq之间有5815个重叠峰,G4-CUT&Tag有12073个独特的峰,G4 ChIP-seq有3387个独特峰。这表明原位捕获和体外捕获策略可能导致不同的G4图谱。对G4峰的注释表明,大多数G4s定位于基因启动子,G4峰的子集分布在基因和基因间区。与其高信噪比相一致,G4-CUT&Tagd 12073个独特峰大部分在基因启动子区,这些区域通常包含增强子,这表明G4-CUT&Tag在检测G4s方面比ChIP-seq更敏感(图5)。


图4 CUT&tag的生物学重复相关性


图5 CUT&Tag和ChIP-seq的结果比较

         

3. G4s与ATAC-seq的信号呈正相关

为了研究天然G4和表观遗传图谱之间的关系,文章分析了Pol II(POLR2A亚单位)的占位、组蛋白修饰(包括H3K27ac、H3K4me3、H3K4me2和H3K4me1)以及HEK293T细胞中ATAC-seq的染色质可及性。结果发现G4s与Pol II和活性组蛋白修饰共定位,并伴随着启动子和增强子处的高染色质可及性(图6)。全基因组分析显示G4s与活性组蛋白修饰、Pol II占位和ATAC-seq信号呈正相关(图7)。

     

图6 G4-CUT&Tag与ChIP-seq、ATAC-seq结果对比

 

 图7 G4s与活性组蛋白修饰、Pol II占位和ATAC-seq信号呈正相关

 

4. G4s可能参与转录的早期阶段

G4s在基因启动子中普遍存在(约60%;17888个峰中由10647个存在于基因启动子中),具有高Pol II占位、染色质可及性和高水平的组蛋白修饰活性,包括H3K27ac、H3K4me2和H3K4me3(图8)。metaplot分析显示G4s在两个以H3K27ac标记的核小体之间的无核小体区域与Pol II共定位(图9)。文章进一步比较了G4布和PRO-seq(一种用于测量新生RNA 3‘端并绘制参与转录的Pol II因子)信号的分布发现G4信号与启动子区域的TSSs和Pol II 暂停位点重叠(图9),表明G4s可能参与转录的早期阶段。

 

图8 HEK293T细胞启动子区G4、组蛋白修饰、POLR2A占位和ATAC-seq信号热图分析

 

图9 G4信号与启动子区域的TSSs和Pol II 暂停位点重叠 

 

5. G4s具有细胞类型特异性

为研究天然G4s的细胞类型特异性,文章分析了不同细胞系中的G4谱,包括胚胎肾细胞(HEK293T)慢性粒细胞白血病细胞(K562)、宫颈癌细胞(HeLa)、小细胞肺癌细胞(SW1271)和乳腺癌细胞(MBD-231-LM2)(图10)。这些细胞系之间G4峰重叠程度低表明G4具有高度的细胞类型特异性,如维恩图所示(图11)。Pearson对G4-CUT和Tag信号的相关性也显示了不同细胞系之间G4s的巨大异质性(图12)。总之,这些数据表明G4的分布和信号强度在不同的细胞中差异很大,表明G4的细胞类型特异性,可能反映了不同细胞系之间不同的表观遗传和转录程序。

  

图10 不同细胞系的G4谱

  

图11 不同细胞系之间G4峰重叠韦恩图

 

 图12 G4-CUT&Tag 信号在不同细胞系中的相关性

 

 

四 、结论 

 

通过对这篇文章的部分解读可知:1)CUT&Tag不仅可以用于研究组蛋白和转录因子这种蛋白,也可以用于研究核酸序列,前提是有合适的抗体;2)CUT&Tag技术与ChIP-seq相比具有多方面的优势。当然,我们此次解读的这篇文章研究内容非常丰富,信息量大,篇幅所限,不做一一介绍,感兴趣的可以查看原文。

 

上海欧易生物完成了多例CUT&Tag项目,积累了丰富的经验,欢迎感兴趣的老师垂询。

 

服务热线:021-34781616

热线电话:13482519071(张女士)

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