一、 简介 

 

CUT&Tag是蛋白质-DNA互作关系研究的新方法，2019年弗雷德哈钦森癌症研究中心的Henikoff博士在Nature Communication公开了该技术的详细结果与实验方案。与以往的ChIP-Seq、pA-MNase等方法相比，这种技术方法简便易行，信噪比高，重复性好，需要的细胞数量少至60个细胞，且有望将ChIP-Seq做到单细胞水平。

 

本文将就近期发表在Genome Research上的一篇文章为例介绍本技术的一个应用场景。

 

与我们以往的经验不同，本文的研究对象不是组蛋白，也不是转录因子，而是G-四链体（G4）。

 

G-四链体（G4s）是通过鸟嘌呤自结合形成的非规范DNA二级结构，是一种暂时性结构，大量存在于即将分裂的细胞中，可参与多种生物过程，包括基因转录、DNA复制、基因组不稳定性以及端粒延长和维持（Varshney et al.2020）。基因转录是染色质松弛和单链DNA（ssDNA）暴露的驱动力，这是G4形成的先决条件。2020年8月有研究表明G-四链体的丰度和位置在癌症中有重要作用，可以作为开发诊疗方法，对抗乳腺癌的重要潜在靶点。另外也有研究表明，每种乳腺癌亚型都有不同的G-四链体模式或“景观”。确定肿瘤中G-四链体的特殊模式，有助于查明乳腺癌亚型，从而提供更具针对性的精准治疗。然而，关于G4s在转录调控中的确切作用的全基因组研究仍然缺乏。

 

本文建立了一种敏感的G4-CUT&Tag方法，用于高分辨率和特异性的天然G4s全基因组分析。

 

 

二 、材料与方法 

 

1. 材料

（1）HEK293T细胞

（2）带有His-tag的Flag-BG4抗体

2.方法：见图1

图1 CUT&Tag实验流程

 

 

三 、实验结果 

 

1. G4-CUT&Tag技术的信噪比及分辨率高于ChIP-seq技术

与G4 ChIP-seq相比，G4-CUT&Tag在启动子区域产生的信号更高，背景信号更少（图2）分辨率更高（图3）

 

图2 G4-CUT&Tag数据背景信号低

图3 G4-CUT&Tag分辨率高

         

2. G4-CUT&Tag技术生物学重复性高

生物学重复之间的高度相关性说明G4-CUT&Tag的再现性比较高（图4）研究发现G4-CUT&Tag和G4 ChIP-seq之间有5815个重叠峰，G4-CUT&Tag有12073个独特的峰，G4 ChIP-seq有3387个独特峰。这表明原位捕获和体外捕获策略可能导致不同的G4图谱。对G4峰的注释表明，大多数G4s定位于基因启动子，G4峰的子集分布在基因和基因间区。与其高信噪比相一致，G4-CUT&Tagd 12073个独特峰大部分在基因启动子区，这些区域通常包含增强子，这表明G4-CUT&Tag在检测G4s方面比ChIP-seq更敏感（图5）。

图4 CUT&tag的生物学重复相关性

图5 CUT&Tag和ChIP-seq的结果比较

         

3. G4s与ATAC-seq的信号呈正相关

为了研究天然G4和表观遗传图谱之间的关系，文章分析了Pol II（POLR2A亚单位）的占位、组蛋白修饰（包括H3K27ac、H3K4me3、H3K4me2和H3K4me1）以及HEK293T细胞中ATAC-seq的染色质可及性。结果发现G4s与Pol II和活性组蛋白修饰共定位，并伴随着启动子和增强子处的高染色质可及性（图6）。全基因组分析显示G4s与活性组蛋白修饰、Pol II占位和ATAC-seq信号呈正相关（图7）。

     

图6 G4-CUT&Tag与ChIP-seq、ATAC-seq结果对比

 

 图7 G4s与活性组蛋白修饰、Pol II占位和ATAC-seq信号呈正相关

 

4. G4s可能参与转录的早期阶段

G4s在基因启动子中普遍存在（约60%；17888个峰中由10647个存在于基因启动子中），具有高Pol II占位、染色质可及性和高水平的组蛋白修饰活性，包括H3K27ac、H3K4me2和H3K4me3（图8）。metaplot分析显示G4s在两个以H3K27ac标记的核小体之间的无核小体区域与Pol II共定位（图9）。文章进一步比较了G4布和PRO-seq（一种用于测量新生RNA 3‘端并绘制参与转录的Pol II因子）信号的分布发现G4信号与启动子区域的TSSs和Pol II 暂停位点重叠（图9），表明G4s可能参与转录的早期阶段。

 

图8 HEK293T细胞启动子区G4、组蛋白修饰、POLR2A占位和ATAC-seq信号热图分析

 

图9 G4信号与启动子区域的TSSs和Pol II 暂停位点重叠 

 

5. G4s具有细胞类型特异性

为研究天然G4s的细胞类型特异性，文章分析了不同细胞系中的G4谱，包括胚胎肾细胞（HEK293T）慢性粒细胞白血病细胞（K562）、宫颈癌细胞（HeLa）、小细胞肺癌细胞（SW1271）和乳腺癌细胞（MBD-231-LM2）（图10）。这些细胞系之间G4峰重叠程度低表明G4具有高度的细胞类型特异性，如维恩图所示（图11）。Pearson对G4-CUT和Tag信号的相关性也显示了不同细胞系之间G4s的巨大异质性（图12）。总之，这些数据表明G4的分布和信号强度在不同的细胞中差异很大，表明G4的细胞类型特异性，可能反映了不同细胞系之间不同的表观遗传和转录程序。

  

图10 不同细胞系的G4谱

  

图11 不同细胞系之间G4峰重叠韦恩图

 

 图12 G4-CUT&Tag 信号在不同细胞系中的相关性

 

 

四 、结论 

 

通过对这篇文章的部分解读可知：1）CUT&Tag不仅可以用于研究组蛋白和转录因子这种蛋白，也可以用于研究核酸序列，前提是有合适的抗体；2）CUT&Tag技术与ChIP-seq相比具有多方面的优势。当然，我们此次解读的这篇文章研究内容非常丰富，信息量大，篇幅所限，不做一一介绍，感兴趣的可以查看原文。

 

上海欧易生物完成了多例CUT&Tag项目，积累了丰富的经验，欢迎感兴趣的老师垂询。

 

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