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项目文章 | 西北农林科技大学发现小麦TaFDL2-1A和TabZIP8-7A介导抗旱分子机制

人阅读 发布时间:2021-10-12 10:51

 

2021年8月,西北农林科技大学旱区作物逆境生物学国家重点实验室李学军教授在Plant Science杂志中发表了题为“TaFDL2-1A interacts with TabZIP8-7A protein to cope with drought stress via the abscisic acid signaling pathway”的研究论文,报道了小麦基因TaFDL2-1A 和 TabZIP8-7A介导的耐干旱分子机制。

 

文章中酵母杂交工作为上海欧易生物协助完成。

 

 研究背景 

干旱是限制谷物生产的主要环境因素,在1964-2007年期间,干旱造成的平均损失为10.1%。了解应对干旱胁迫的关键基因对于提高作物产量至关重要。最近,一些在植物对干旱胁迫的反应中起重要作用的基因被鉴定出来,包括转录因子(TFs)、激酶、分子链和其他功能蛋白。其中拟南芥和水稻中的bZIP转录因子在干旱胁迫响应中的分子机制研究的较为清楚,但是对小麦中bZIP转录因子在干旱胁迫中的研究较少。

 

 研究内容 

本研究从小麦中分离到三个编码核蛋白的TaFDL2同源基因,干旱和ABA处理可诱导这三个基因的表达。在拟南芥中过表达TaFDL2-1A或其相互作用蛋白TabZIP8-7A可提高植株抗旱性和对ABA的敏感性。遗传和转录调控分析表明TaFDL2-A或TabZIP8-7A通过ABA信号通路促进应激响应基因表达。此外,TaFDL2-1A和TabZIP8-7A通过形成转录激活复合物以更有效的方式协同激活ABA诱导的基因表达。研究结果表明TaFDL2-1A通过ABA信号途径与TabZIP8-7A相互作用以应对干旱胁迫。

 

 研究结果 

1. TaFDL2基因的分离鉴定

在春小麦中共找到3个TaFDL2同源基因,分别位于染色体1A、1B和1D(图1)上,命名为TaFDL2-1A, TaFDL2-1B, and TaFDL2-1D, 分别含有328,326和327个氨基酸,三个基因具有约98%的序列同源性。

 

分析发现三个同源基因的启动子区域(起始密码子上游1.5 Kb的序列)含有许多预测的应激反应相关顺式作用元件(http://bioinformatics.psb.ugent.be)(图1),例如MYB识别位点、MYC识别位点、W box、ACE、DRE和G-box等,基于高度保守的氨基酸序列和类似的顺式作用元件,可以认为三个TaFDL2同源基因可能具有平行的生物学功能。

图1 TaFDL2的基因定位及元件分析

 

2. TaFDL2的表达及亚细胞定位

利用qRT-PCR分析应激处理下TaFDL2的表达模式以评估启动子区域的多个应激反应相关顺式作用元件。结果表明干旱、PEG6000和外源ABA的处理均可诱导这三个基因的表达(图2),从而说明TaFDL2-1A、TaFDL2-1B和TaFDL2-1D在某些方面尤其是在干旱胁迫中可能存在功能冗余。TaFDL2-1A、TaFDL2-1B和TaFDL2-1D三个基因在各组织中都能被检测到,其中TaFDL2-1A的表达水平最高(图2)。后续选择TaFDL2-1A进行进一步实验。对TaFDL2的亚细胞定位分析表明这三种蛋白都在细胞核中表达(图3)。


图2 TaFDL2的表达模式分析

 

图3 TaFDL2的亚细胞定位

 

3. TaFDL2-1A的转录活性

TaFDL2是一种bZIP TF,自激活检测结果显示完整的TaFDL2-1A具有转录激活活性,且TaFDL2-1A包含两个激活结构域。其中结构域D(129-151aa)对这两个结构域的转录活性有不同的影响(图4)。

图4 TaFDL2-1A的转录活性检测

 

4. TaFDL2-1A的拟南芥过表达植株耐旱性和ABA敏感性增强

TaFDL2-1A的拟南芥过表达植株在干旱处理中其抗旱性明显优于野生型,干旱处理后,WT的相对含水量(RWC)、叶绿素含量、气孔孔径和叶片失水率以及重新浇水后的存活率(图5)显著低于过表达株系。此外,过表达TaFDL2-1A的株系莲座叶发育迟缓且花期提前,但是最终的株高与野生型无明显差异。在所有情况下,TaFDL2-1A的过表达植株增加了对干旱胁迫的耐受性。此外,在干旱条件下,转基因植物中的脯氨酸含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性高于野生型植物,而丙二醛(MDA)含量较低(图5)。

 

这些结果表明,脯氨酸含量和抗氧化酶活性水平可能在TaFDL2-1A过表达植物的抗旱能力中起着重要作用。ABA敏感性试验发现,在ABA处理下,OE1、OE3和OE7中具有绿色子叶的幼苗的百分比显著低于WT,但在对照条件下没有显著差异(图5)。这些结果表明,TaFDL2-1A转基因株系表现出ABA超敏反应。

图5 过表达TaFDL-1A植株的各项指标

 

5. TabZIP8-7A与TaFDL2-1A具有相互作用

选择BD C2(152-328 aa)通过酵母双杂交(Y2H)筛选相互作用蛋白。筛选到的三个阳性克隆含有相同的编码序列(CDS),该基因位于7A染色体上。命名为TabZIP8-7A。将全长TabZIP8-7A融合到GAL4激活域(AD-TabZIP8-7A),然后与BD-C2共转化到Y2HGold酵母菌株中。结果表明,TabZIP8-7A在酵母中与TaFDL2-1A具有相互作用(图6)。

 

Pull down和Bifc实验结果都表明TaFDL2-1A在体内和体外都与TabZIP8-7A相互作用。TaFDL2的三个同源基因都可在ABA和干旱处理下被诱导表达, ABA和干旱胁迫处理也上调了TabZIP8-7A的转录水平。这些结果以及TaFDL2-1A和TabZIP8-7A之间的相互作用表明,TabZIP8-7A可能参与ABA信号和抗旱性的调节。

图6 TabZIP8-7A与TaFDL2-1A具有相互作用

 

6. TabZIP8-7A正向调节拟南芥抗旱性和ABA信号通路

过表达TabZIP8-7A的拟南芥植株在干旱处理后显示出比野生型植株略萎蔫和颜色更绿的表型(图7)。干旱条件下,转基因植株叶片的RWC和叶绿素的含量明显高于野生型植株。此外,与野生型相比,TabZIP8-7A过表达植株的脯氨酸含量和SOD活性较高,但是MDA含量、气孔孔径和水分损失较低,且转基因植株的幼苗绿化率低于野生型植物(图7)。这些结果表明,在拟南芥中过表达TabZIP8-7A可增强抗旱性和ABA敏感性。

图7 过表达TabZIP8-7A拟南芥植株表型统计

 

7. TaFDL2-1A×TabZIP8-7A双过表达植株表现出最高的抗旱性

双过表达植株在干旱处理后大多数叶片呈绿色并伸展,而野生型植株的叶片枯萎和萎蔫。在转基因植株和重浇水后的WT中,双过表达植物的存活率最高。此外,在干旱条件下,双过表达植物的叶片RWC、叶绿素含量,脯氨酸含量和SOD活性也最高(图8)。以上结果表明,TaFDL2-1A和TabZIP-7A双过表达植株表现出最大的抗性。在ABA敏感性实验中,在WT和转基因植物种,双过表达植物在ABA处理下的幼苗绿化率最低,从而证明双过表达植株对ABA表现出最高的超敏感性。

图8 双过表达植株的各项生理指标统计

 

8. 转基因拟南芥逆境反应基因表达的增强

使用qRT-PCR检测应激相关基因和活性氧清除相关基因的表达水平。包括P5CS1的六个基因的表达水平,对ABA 18(RAB18)反应,脱水响应元件结合蛋白2A(DREB2A)、脱水响应蛋白29B(RD29B)、ABA响应元件(ABRE)结合因子3(ABF3)和铜/锌超氧化物歧化酶1(CSD1)在干旱胁迫下均上调(图7A-F)。此外,转基因植物中这些基因的表达水平明显高于野生型植物,其中TaFDL2×TabZIP8双过表达植物的表达水平最高(图7A-F)。这些结果与干旱条件下转基因植物的抗逆表型一致。因此,TaFDL2-1A或TabZIP-7A可能通过调控胁迫响应基因在干旱胁迫下发挥积极作用。

 

图9 转基因拟南芥逆境反应基因表达增强

 

9. TaFDL2-1A-TabZIP8-7A复合物具有最高的反式激活活性

研究表明TaFDL2-1A和TabZIP8-7A能与ACGT核心序列结合并激活转录。GUS活性测定结果显示TaFDL2-1A、TabZIP8-7A和TaFDL2-1A-TabZIP8-7A转录激活复合物通过直接结合G-box激活报告基因的转录,其中TaFDL2-1A-TabZIP8-7A复合物具有最高的转录激活活性。此外,TaFDL2-1A和TabZIP8-7A均可直接与EMSA中的TaLEA 7-24启动子结合(图10)。因此,TaFDL2-1A、TabZIP8-7A和TaFDL2-1A-TabZIP8-7A复合物介导ABA诱导基因转录,并且转录水平与干旱条件下转基因植物中胁迫响应基因的表达水平一致。


图10 TaFDL2-1A-TabZIP8-7A复合物具有最高的反式激活活性

 

 研究总结 

本文通过ABA信号通路探讨了TaFDL2-1A在干旱胁迫响应中的作用的分子机制。干旱条件和外源ABA诱导TaFDL2在细胞核中表达,全长TaFDL2-1A具有转录激活活性,并且结构域D对N端和C端的反式激活活性有不同的影响。TaFDL2-1A的过度表达诱导了植株对干旱胁迫的抗性和对ABA的敏感性,并可能通过调控ABA诱导基因在干旱胁迫中发挥积极作用。TabZIP8-7A被鉴定为一种与TaFDL2-1A相互作用的蛋白质,是干旱胁迫和ABA信号通路中的正向调节因子。

 

此外,由TaFDL2-1A与TabZIP8-7A相互作用形成的异源二聚体复合物可以增强TaFDL2-1A或TabZIP8-7A单独的反式激活活性,并且发现共表达TaFDL2-1A和TabZIP8-7A获得最高的相对GUS活性和相对荧光素酶活性。该复合物导致ABA诱导基因的最高表达水平,因此TaFDL2-1A×TabZIP8-7A双过表达植物具有最高的耐旱能力。因此,TaFDL2-1A可以通过ABA信号途径与TabZIP8-7A蛋白相互作用,协同促进干旱胁迫耐受。

 

 参考文献 

Bx Wang, Lq Li, et,al TaFDL2-1A interacts with TabZIP8-7A protein to cope with drought stress via the abscisic acid signaling pathway, Plant Science, 311(2021)111022.
 

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