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运用转录组学揭示银屑病细胞因子 IL-17A 促进表皮增厚

人阅读发布时间：2022-05-20 13:18

前言

银屑病是一种以表皮增生为特征的复发炎症性皮肤病，涉及免疫细胞和角质形成细胞 (KCs) 之间复杂的相互作用关系。目前已经在银屑病的免疫激活方面取得了较多进展，特别是确定了IL-17A 作为驱动核心参与该病理过程。又有研究表明Hippo-YAP信号通路在细胞存活和组织生长中起着至关重要的作用，其靶基因 AREG 可促进银屑病的发生。然而，IL-17A 是否通过调节Hippo-YAP信号通路从而促进角质形成细胞增殖这一过程尚未被探索，所以，探索银屑病调节机制的空白区域对银屑病的治疗是非常重要的。

近日，同济大学附属皮肤病医院史玉玲教授作为通讯作者，在Journal of Investigative Dermatology（IF=8.551）杂志发表了题为“IL-17A Promotes Psoriasis-Associated Keratinocyte Proliferation through ACT1-Dependent Activation of YAP–AREG Axis”的研究论文，报道了银屑病关键细胞因子 IL-17A 影响皮肤角质形成细胞及其促进表皮增厚的分子机制。

研究内容

在本研究中，通过转录组测序、PCR 技术、免疫印迹、免疫荧光分析以及共免疫沉淀等方法对银屑病样本进行分析探究，结果发现 YAP-AREG 通路在银屑病皮肤样本中被激活，并且该通路可以被 IL-17A 单抗（治疗剂）抑制，通过咪喹莫特 (IMQ) 和 IL-17A 诱导可以激活小鼠表皮中的 YAP-AREG 通路。HaCaT 和正常人表皮角质形成细胞的体外研究表明，IL-17A 通过激活 Hippo-YAP 信号传导可以增强 AREG 表达和角质形成细胞的增殖。从机制上讲，IL-17A 刺激角质形成细胞中 MST1 向 ACT1 的募集，这导致了 MST1-LATS1的相互作用和抑制 YAP 磷酸化。总而言之，研究结果揭示了通过激活 YAP-AREG 信号传导，IL-17A 促进银屑病角质形成细胞增殖的机制。

研究结果

YAP-AREG 通路在银屑病患者的皮肤中被激活并被 IL-17A 单抗抑制

通过对人类银屑病患者样本的 RNA 测序数据进行分析，发现 YAP、TEAD4 及其靶基因（包括 AREG、BIRC5、CCNE1、EPGN 和 PLAU）的表达水平在银屑病皮肤病变中普遍上调（图 a)。通过 RT-qPCR 分析验证了这些发现（图 b）。免疫荧光检测到磷酸化 YAP 信号减少和 YAP 信号增加，尤其是在银屑病病变中几乎所有表皮 KC 的细胞核中（图 c- d）。免疫荧光分析还揭示了表达 AREG 的细胞从局限于健康表皮的基底层和棘层扩展到包括银屑病病变中的所有表皮层（图 d）。这些结果表明 YAP 信号在银屑病患者中被激活。

Secukinumab 是 IL-17A 的拮抗剂（IL-17A 单抗），近年来已报道出对银屑病的显著治疗效果。为了检查 IL-17A 抑制对 YAP-AREG 的可能影响，收集了七名银屑病患者在 Secukinumab 治疗前和治疗后 12 周的皮损皮肤组织。通过 RNA-seq 结果分析显示， Secukinumab 给药后，AREG、BIRC5、CCNE1、CTGF 和 EPGN 基因表达水平降低（图 e）。

通过 RT -qPCR 分析验证 AREG 和 BIRC5 的减少（图 f）。Secukinumab 应用还增加了磷酸化 YAP 水平，但降低了患者皮肤表皮中 YAP 和 AREG 蛋白的表达（图 g-h）。这些结果表明，IL-17A 抑制能够减少银屑病患者皮肤中的 YAP-AREG 活化。

图1 | 银屑病中 YAP-AREG 信号被激活并且 Secukinumab 治疗能够抑制该激活过程

IMQ 和 IL-17A 诱导小鼠皮肤组织能够激活 YAP-AREG 信号

对于“YAP-AREG信号参与了银屑病表皮增生过程，且与 IL-17A 作用密切相关”这一猜想，作者使用咪喹莫特 (IMQ) 诱导和 IL-17A 诱导的小鼠模型来进行研究测试。正如预期的那样，用 IMQ 治疗的小鼠出现典型的银屑病样皮肤表型，包括表皮增生，以及 Il-17a 和增殖标志物 Mki67 的显著上调；与人类样本的结果一致，在 IMQ 处理的小鼠损伤皮肤中可以看到 Areg 和蛋白质的表达升高，并且 YAP 信号在 IMQ 处理的表皮中被激活（图 a - d）。

为了评估 IL-17A 对 YAP-AREG 轴的影响，将 IL-17A 连续 6 天注射到小鼠左耳皮下（右耳接受 PBS 作为对照）。尽管在 IL-17A 处理的耳朵中没有观察到明显的外部表型，但与右耳相比，IL-17A 处理的耳朵的厚度显著增加（图 e - g）。重要的是，IL-17A 处理导致 Mki67 和 AREG 的表达显著增加（图 h-i），并降低了磷酸化 YAP 的水平并提高了耳表皮中的总 YAP 水平（图 j）。

这些结果表明，在 IMQ 治疗的小鼠模型中，IL-17A 诱导的角质细胞（KCs）过度增殖且伴随着 YAP-AREG 通路的激活。

图2 | YAP-AREG 信号在 IL-17A 作为其关键调节因子的 IMQ 诱导的银屑病小鼠模型中升高

IL-17A 通过激活 HaCaT 细胞中的 Hippo-YAP 信号增强 AREG 表达并促进细胞增殖

为了进一步研究 IL-17A 对 Hippo YAP 信号传导的影响，用 IL-17A 刺激 HaCaT 细胞、NHEK 细胞。结果发现，增殖标记物 MKI67 水平升高，而分化标记物（FLG、IVL、LOR、KRT1和KRT10）表达水平则下调（图 a）。值得注意的是，在 IL-17AEA 处理的 HaCaT 细胞中，AREG 表达水平和培养上清液浓度显著增加（图 b-c）。细胞计数分析表明，IL-17A 促进 HaCaT 细胞的增殖，小干扰 RNA（siRNA）介导的 AREG 沉默基本上消除了这种效应（图 d）。因此，IL-17A 的 KCs 增殖增强作用依赖于 AREG。

此外，为了检测 IL-17A 是否改变 HaCaT 细胞中的 YAP 信号，作者通过 WB 分析、免疫印迹、免疫荧光分析和共免疫沉淀等分析，结果表明 IL-17A 能够激活 Hippo-YAP 信号通路，抑制 YAP 的降解，促进细胞核内 YAP 的分布以及与转录因子 TEAD4 的相互作用，最终上调效应分子 AREG 的表达和分泌（图 e-l）。

总之，这些结果证明了 IL-17A 通过激活 HaCaT 细胞中的 Hippo-YAP 信号来增强 AREG 表达并促进细胞增殖。

图3 | IL-17A 通过 Hippo-YAP 通路上调 AREG 表达并促进角质形成细胞增殖

沉默 ACT1 能够阻断 IL-17A 对于 YAP-AREG 信号的调控作用

ACT1 是已知的 IL-17R 信号传导的细胞内适配器，为了探索 ACT1 在 IL-17A 促进 AREG 表达和角质形成细胞增殖中的作用，作者通过沉默 ACT1 基因表达，发现 AREG 的表达和分泌上调，以及IL-17A处理后细胞增殖的上调，在很大程度上被 ACT1 缺失逆转（图 a-h）。为了确定 ACT1 是否参与了 IL-17A 诱导的 Hippo-YAP 信号的激活，作者通过检测关键信号成分的水平和磷酸化水平，在 HaCaT 和 NHEK 细胞中，ACT1 敲除使 IL-17AE 诱导的磷酸化 YAP 和 MST1/2 的减少被逆转，并阻断 IL-17A 诱导的 YAP 核积累上调（图 i - m）。值得注意的是，ACT1 缺失也消除了 IL17A 诱导的 YAP 和 TEAD4 之间的相互作用（图 n）。

图4 | 沉默 ACT1 能够阻断 IL-17A 对于 YAP-AREG 信号的调控作用

IL-17A 通过将 MST1 招募到 ACT1 来激活 YAP 信号

为了阐明 IL-17A 激活 YAP 信号的分子机制，通过共免疫沉淀分析、细胞转染和基因敲除等实验，以验证 ACT1 可以在 IL-17A 存在的情况下直接招募 MST1 的假设。结果发现，IL-17A 刺激 HaCaT 细胞导致 ACT1 和 MST1 之间的相互作用短暂增强，而 MST1 和 LATS1 之间的相互作用明显受损，IL-17A增强了 HA 标记的 MST1 和 His 标记的 ACT1 之间的相互作用，但减弱了 HA 标记的MST1和LATS1之间的相互作用，被 IL-17A 处理削弱的 MST11 相互作用可以通过 ACT1 缺失得以恢复（图 a-c）。

这些结果揭示了以往未有报道的 IL-17Rs 信号适配器ACT1 和 Hippo 信号之间的相互作用。研究表明，IL-17A 可能通过将 MST1 招募到 ACT1 并破坏 Hippo 信号的磷酸化来激活 Hippo-YAP 信号。