维生素C(即抗坏血酸:AA)是人体正常细胞健康和发育所必需的一种基本微量营养素。人体细胞本身不能产生维生素C，需要通过肠道吸收和血液循环从周围环境中获取维生素C。小鼠可以在肝脏中合成一定量的维生素C，然后分布到各组织中，但内源性合成的VC不能完全满足小鼠脑细胞的代谢需要，小鼠大脑仍然依赖于肠道对维生素C的吸收及其循环。

 

大脑的高强度代谢活性使这个器官特别容易受到氧化应激和自由基损伤，VC作为人体内高效的抗氧化剂，当大脑中维生素C水平不足时会导致阿尔茨海默症（AD）病人认知能力下降加速，β-淀粉样蛋白积累和沉积。因此了解大脑中AA的吸收机制，对理解不同疾病状态下维生素C摄取变化的潜在病理机制具有重要意义。

 

在神经元中，AA的摄取依赖于人类钠依赖性维生素C转运体-2 (hSVCT2)，这是大脑中主要表达的维生素C转运体亚型。然而，目前对维生素C转运体的工作方式知之甚少，也不知道它是如何在不同的细胞类型(包括对维生素C有高需求的细胞，如神经元)中定向调节转运的。

 

2021年，加利福尼亚大学团队在International Journal of Biological Macromolecules上发表的题为“Calsyntenin-3 interacts with the sodium-dependent vitamin C transporter-2 to regulate vitamin C uptake”的研究论文，利用酵母双杂交技术，筛选到了hSVCT2的互作蛋白Calsyntenin-3（CLSTN3），研究发现该组相互作用对VC吸收具有正向调节作用，对预防衰老相关的认知衰退和AD具有重要的生理病理学意义。

 

 

 

文章思路与结果

 

酵母双杂交筛选获得了人VC钠依赖转运蛋白hSVCT2的互作蛋白CLSTN3

 

以hSVCT2 C端（567-650 aa）为诱饵，通过酵母双杂交筛选成年人类大脑cDNA酵母文库，结果获得253个候选阳性克隆，PCR鉴定测序分析发现CLSTN3互作可信度较高，进一步通过Y2H一对一验证，发现hSVCT2 C端（567-650 aa）与hCLSTN3 (507–639 aa)在-His/+10 mM 3-AT筛选条件下存在相互作用。

 

 

在哺乳动物细胞中验证hCLSTN3与hSVCT2存在相互作用

 

通过Co-IP、Dual-LUC、细胞内共表达进一步验证了全长蛋白hCLSTN3与hSVCT2在哺乳动物细胞中存在相互作用。

 

 

hCLSTN3对hSVCT2功能的影响

 

通过对比检测hSVCT2单独瞬转SH-SY5Y，以及hCLSTN3和hSVCT2共同瞬转SH-SY5Y后，细胞C-AA摄取情况，发现hCLSTN3和hSVCT2共表达可以增强细胞AA吸收水平。通过siRNA敲降hCLSTN3，发现细胞AA吸收水平明显下降，但hSVCT2表达量不变，说明蛋白hCLSTN3对hSVCT2功能具有辅助作用，表现为可以通过与其互作，提高hSVCT2的AA转运功能，但并不会调控其表达量。

 

 

在正常人及AD患者海马体中SVCT2和CLSTN3的表达量差异

 

既往研究发现AD患者血浆维生素C水平低于健康人，本研究通过qPCR及WB检测，发现在小鼠模型及AD临床病人中，SVCT2和CLSTN3的表达量均低于正常个体。

 

Fig. 4 | Effect of AD on expression level of hSVCT2 and hCLSTN3 protein and mRNA in normal and AD hippocampus.

 

本研究结果表明hCLSTN3与hSVCT2相互作用，hCLSTN3表达与维生素C摄取呈正相关。这两种蛋白在AD疾病状态下下调提示AD患者的大脑中维生素C稳态受损。
 

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