据估计，全世界的医院和组织库中大概有四亿到十亿份FFPE样本。对于某些类型的肿瘤组织，FFPE样品通常是核酸的来源，这些样本可以为研究人员提供有关某些罕见的癌症和其他疾病的重要信息。利用FFPE样本进行DNA高通量测序已经是常规技术（全外显子测序和重测序），且已经产生了大量数据。而使用FFPE样本开展转录组水平的测序工作报道相对比较少。

 

今年3月，Frontiers in Endocrinology(IF:6.055)发表的一篇文章评估了肾上腺皮质肿瘤FFPE样本可以进行全转录组测序的效果。从本文结果来看，FFPE样本是可以用来进行RNA抽提和建库测序，且其数据结果与新鲜冻存样本的数据结果差异不大。

 

 

一、样本：

1、肾上腺皮质癌样本（ACC）新鲜冻存和FFPE样本各3份；

2、产生醛固酮的腺瘤（APA）新鲜冻存和FFPE样本各3份；

3、皮质醇生成腺瘤（CPA）新鲜冻存和FFPE样本各3份。

 

二、材料与方法

1、RNA抽提质检：

（1）新鲜冻存样本使用Trizol抽提RNA，FFPE样本使用Promega的Maxwell RSC RNA FFPE kit抽提RNA。

（2）RNA质检使用Bioanalyzer 2100， RNA质量的判定使用RIN值和DV200两项指标。

 

2、建库：

使用NEBNext rRNA去除试剂盒及NEBNext Ultra II Direcational RNA建库试剂盒。

 

三、结果分析

1、RNA抽提分析

与新鲜冻存的样本相比，FFPE样本的RNA抽提得率、RIN值和DV值均偏低（图1）。FFPE样本的RNA浓度平均值为36ng/μL， RIN值平均值仅为2.2， DV200平均值为47.6%；而新鲜冻存样本的RNA浓度为464.5ng/μL， RIN值平均值为7.9，DV200平均值为71%。将FFPE样本分成存放时间大于340天小于340天两组，新鲜冻存样本分成存放时间大于427天和小于427天，分别对RNA浓度、RIN值和DV200进行统计发现，无论是FFPE样本还是冷冻样本存放时长对RNA的得率、RIN值和DV200均无明显影响。

 

图1 | FFPE与新鲜冻存样本RNA质控统计

 

2、RNA测序数据分析结果

（1）FFPE样本与新鲜冻存样本RNA分别建库测序，得到的原始数据相近，分别为33M reads和32.9M reads。但是两者的基因组比对率差异较大，其中FFPE样本的基因组比对率为82.9%，而冻存样本的基因组为 87.7%。因此FFPE样本所得到的可用于分析的reads数明显少于冻存样本。但是二者分析得到的基因数并无明显差别，平均值分别为18160 和 18001。

 

图2 | FFPE样本和新鲜冻存样本可分析reads数和鉴定到的基因数

 

（2）用标准化后的测序数据进行各组样本的相关性分析发现，FFPE样本与新鲜冻存样本数据的相关性的平均值为0.93（图3），而且采用FFPE样本所得到的基因表达结果与新鲜冻存样本的表达结果相似，但是可检测的转录本数少于新鲜冻存细胞。

 

图3 | FFPE样本与新鲜冻存样本测序数据的相关性

 

（3）为确认FFPE样本的转录组测序结果是否能够用于区分ACC、APA和CPA样本，首先评估了新鲜冻存样本的转录组测序数据是否能够区分上述三种癌症，结果表明新鲜冻存样本可以较好的对三种癌症进行区分，而对FFPE样本的测序数据结果进行分析后发现，FFPE样本所得到的结果与新鲜冻存样本结果一致（图4）。

 

图4| 聚类分析结果

 

（4）对比同组的FFPE样本和新鲜冻存样本的基因表达情况，ACC组的FFPE样本中有402个差异基因，其中161个上调，241个下调。在ACC组的新鲜冻存样本中则有356个差异表达基因，其中148个上调，208个下调，两者的共有基因为193个，其中76个上调，117个下调。

对APA和CPA的FFPE样本和新鲜冻存样本分别进行分析，结果表明FFPE样本产生的数据能够用来鉴定APA和CPA特异基因。

 

四、结论

1、FFPE样本能够用来抽提RNA并进行转录组建库测序；

2、FFPE样本抽提RNA得率、RIN值及DV200与新鲜冻存样本有较大差异；

3、在肾上腺皮质肿瘤中可以使用FFPE样本替代新鲜冻存样本进行疾病marker基因的鉴定；

4、在肾上腺皮质肿瘤的FFPE样本的RNA表达模式与新鲜冻存样本的RNA表达模式高度相似；

5、FFEP样本能够进行组织形态观察，从而使显微切割获得特定部位的组织和细胞成为可能；

6、本篇文章的缺点是没有能够取到保存年限更长的样本进行研究。

7、本篇文章为大量的FFPE样本的使用挖掘提供了新思路。
 

引用文献

Iwahashi et,al., Whole transcriptome profiling of adrdnocortical tumors using formalin-fixed paraffin-embedded samples, Fromtiers in Endocrinology, February 2022, Volume 13, Article 808331.

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