艰难梭菌感染（Clostridioides diffcile infection，CDI）是医疗中胃肠道感染的主要原因，艰难梭菌是一种形成孢子的机会病原体，当正常肠道微生物群被破坏时，它会导致结肠感染。CDI相关疾病表现为腹泻和腹痛，严重时可导致伪膜性结肠炎和中毒性巨结肠。由于频繁复发的感染、抗生素耐药性和出现的高毒力菌株，治疗仍然困难。

 

来自美国波士顿儿童医院和哈佛医学院儿科消化内科的Min Dong团队和来自美国波士顿儿童医院泌尿外科Meenakshi Rao团队在Nature发文题为C.difficile intoxicates neurons and pericytes to drive neurogenic inflammation，发现艰难梭菌使神经元和周细胞中毒，从而引发神经源性炎症。因此，靶向神经源性炎症为治疗CDI提供了一种以宿主为导向的治疗方法。

 

艰难梭菌主要通过两种同源毒素的作用引起疾病：毒素 A（TcdA）和TcdB。TcdA和TcdB的酶结构域是葡萄糖基转移酶（glucosyltransferases 称为GTD），它修饰小GTP酶上的一个关键残基并抑制其活性，从而导致肌动蛋白细胞骨架的破坏，最终导致细胞变圆。

 

神经源性炎症是一种公认的现象，其中感觉神经元释放促炎神经肽，如SP和CGRP。这些导致快速血管舒张和血管通透性增加，导致血浆和免疫细胞外渗到组织中。SP作用于内皮细胞，诱导血浆外渗，CGRP在血管舒张中的作用也得到了很好的证实。已经观察到CDI中与神经源性炎症一致的症状，包括中性粒细胞浸润、极度水肿和结肠血管通透性增加。但是，神经源性炎症在CDI发病机制中的作用尚待确定。

 

先前的研究表明，在动物模型中，当TcdA注射到结扎的小肠环中时，会诱导炎症反应。这些反应通过阻断SP或CGRP信号或通过对投射到环的感觉神经元进行手术去神经支配而减弱。这些结果表明TcdA在神经源性炎症中起作用。然而，这些发现与体内CDI的相关性以及潜在的分子机制尚未确定，CDI主要影响结肠而非小肠。

 

最近的研究表明，TcdB是与发病机制相关的更重要的毒素，仅TcdB就足以引起全谱疾病。TcdB如何诱导结肠炎症以及SP和CGRP信号传导是否参与仍不清楚。在这里，报道了TcdB通过不同的受体直接靶向肠道神经支配肽能神经元和血管周细胞，以诱导神经元释放神经肽并引起神经源性炎症。SP或CGRP信号传导的遗传或药理学阻断降低了TcdB给药和CDI小鼠模型中的发病机制和艰难梭菌的体内定殖。

 

1、TcdB诱导神经源性炎症

 

将TcdB直接注射到野生型（WT）小鼠的盲肠腔中，发现TcdB引起水肿和1h内中性粒细胞浸润 。

SP和CGRP是血管舒张和中性粒细胞渗入皮肤和其他组织的关键驱动因素。暴露于TcdB后，盲肠组织中两者的水平均增加，快速时间尺度与组织病理学变化有关检查了缺乏SP或CGRP信号的敲除（KO）小鼠。Tac1（编码SP和神经激肽的前肽 A）和Nk1r（编码神经激肽 1受体，SP的高亲和力受体）KO小鼠在TcdB注射后的组织病理学评分明显低于WT对照组。CGRP有两种由不同基因编码的密切相关的形式：Calca（编码CGRPα）和Calcb（编码CGRPβ）。Calca-null小鼠具有与WT对照相似的组织病理学，而Calcb-null小鼠在给予TcdB后表现出组织病理学评分降低相反，将SP与TcdB一起施用到盲肠腔中恢复了Tac1-KO小鼠对TcdB的易感性这些数据表明，SP和CGRPβ对TcdB诱导的快速炎症反应至关重要。

 

为了验证SP和CGRPβ在CDI中的作用，我使用了CDI的抗生素治疗小鼠模型。用抗生素预处理的小鼠感染广泛使用的艰难梭菌菌株（630Δerm）的孢子，该菌株产生TcdA和TcdB。与WT小鼠相比，感染艰难梭菌630∆erm的Tac1 KO小鼠、Nk1r KO小鼠和Calcb KO小鼠的组织病理学评分较低。

 

2、TcdB通过FZD受体靶向感觉神经元

 

盲肠和结肠由肠神经系统（ENS）的内源性神经元和主要位于背根神经节（DRG）的外源性神经元的投射物支配。FZD1、FZD2和FZD7（FZD1/2/7）和硫酸软骨素蛋白多糖  4（CSPG4）是TcdB的公认受体。对已发表的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据的分析表明，FZD1、FZD2和FZD7转录物在小鼠和人类结肠的ENS神经元中表达，其水平高于包括上皮细胞在内的许多其他肠道细胞类型。FZD1/2/7先前已在DRG神经元中报道，并在感觉神经元敏化中发挥作用。小鼠结肠支配DRG神经元的scRNA-seq也显示FZD1/2/7的表达，原位杂交证实FZD1/2/7在DRG中表达。与FZD1/2/7的表达一致，培养的小鼠DRG神经元对TcdB高度敏感，并且暴露于TcdB导致SP分泌并导致可见的轴突损伤。具有破坏小GTP酶的葡糖基化突变的突变体TcdB（TcdB-GtdM）32没有诱导SP释放。先前生成并验证了一个缺乏与FZD1/2/7结合的TcdB突变体（TcdB-FzM）。这种突变毒素没有诱导DRG神经元释放SP。TcdB的作用在体内得到进一步证实。在小鼠盲肠注射试验之后，TcdB处理增加了盲肠组织外植体内SP的释放，而TcdB-FzM显示出降低的效力。这些发现表明，TcdB通过FZD1/2/7进入外周感觉神经元，并且中毒诱导神经肽分泌。

 

3、TcdB通过CSPG4靶向周细胞

 

与FZD1/2/7不同，CSPG4不由神经元表达，以前被认为由结肠肌成纤维细胞表达。然而，最近对人类结肠组织的scRNA-seq表明，CSPG4的表达在血管壁细胞中高度富集，包括周细胞和血管平滑肌细胞。使用CSPG4-DsRed转基因小鼠，其中CSPG4启动子驱动荧光DsRed报告基因表达。共聚焦成像显示DsRed+细胞有两个群体。一个群体由包围大分支血管的细胞组成，并且具有血管平滑肌细胞的典型形态。另一组细胞具有精细突起，包裹在结肠粘膜的上皮下血管周围。

为了测试CSPG4对TcdB靶向周细胞的必要性，使用了分离的原代人脑周细胞，因为无法培养肠道周细胞。TcdB在诱导周细胞变圆方面非常有效。缺乏与CSPG4结合的TcdB突变毒素（TcdB-Cspg4M）显示出与TcdB-FzM不同的显著降低的效力。缺乏与FZD1/2/7和CSPG4结合的双突变体TcdB-FzCspg4M显示出与TcdB-Cspg4M相似的效力。为了验证TcdB是否在体内通过CSPG4靶向周细胞，使用了一种耳朵注射模型，该模型能够对耳朵小动脉周围的周细胞进行成像，这在肠道组织中很难做到。TcdB或TcdB-FzM的注射诱导耳小动脉周围细胞的收缩，而TcdB-Cspg4M的注射没有显示出效果。

 

周细胞通过改变细胞形态和分泌炎性胞质分裂来调节血管扩张和免疫细胞迁移。TcdB，而不是TcdB-Cspg4M，诱导人脑周细胞分泌白细胞介素-8（IL-8）。一致地，在盲肠注射模型中暴露于TcdB增加了体内盲肠组织中细胞因子CXCL1（一种小鼠IL-8同源物）的水平。WT小鼠中的TcdB-Cspg4M或Cspg4-KO小鼠中的TcdB均未增加CXCL1水平。

 

考虑到神经元和周细胞都是血管功能的主要调节物，评估了它们整合信号的能力。泛神经元标记TUBB3的免疫组织化学染色显示粘膜中神经和CSPG4+周细胞的混合网络。这些神经纤维中的许多对CGRP呈免疫反应，CGRP+静脉曲张与包裹内皮细胞的DsRed标记的周细胞密切相关。培养的人周细胞表达CGRP受体成分CALCRL和RAMP1，并且将CGRP添加到培养诱导了IL-8的分泌。这些结果证实了CGRP可以调节周细胞。

 

4、脚垫模型中的TcdB动作

 

神经源性炎症在皮肤组织中已经得到了很好的研究，其中肽能伤害性感觉神经元的激活驱动快速水肿和中性粒细胞浸润。为了进一步评估FZD介导的TcdB对感觉神经元的靶向作用，使用了皮下脚垫注射小鼠模型，其中可以通过测量水肿（脚垫厚度）来评估神经源性炎症的发生。TcdB在该模型中的注射诱导水肿在15分钟内迅速发展 ，类似于注射辣椒素，其激活瞬时受体电位阳离子通道亚家族 V形构件 1（TRPV1）在伤害性感觉神经元中的表达。阿瑞匹坦是一种NK1R的小分子拮抗剂，经美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于临床，用它阻断SP信号传导可以防止TcdB诱导的水肿。最终表明，靶向FZD1/2/7足以诱导神经源性炎症，这一结果与感觉神经元作用于周细胞上游的模型一致。

 

5、TcdB-GTD向神经元的递送诱导炎症

 

为了确定神经元中的TcdB-GTD酶活性是否足以诱导神经源性炎症，开发了一种焦油效应物递送方法，称为毒物学。

 

注射低滴度AAV-DTR（约1 × 10¹¹）插入Tac1^cre小鼠导致DRG和ENS神经元中DTR的表达，但没有非神经元TAC1+细胞，如肠嗜铬细胞。构建了一个由TcdB GTD组成的融合蛋白与ciDT融合的结构域（GTD–ciDT）。GTD–ciDT注入未感染对照小鼠的脚垫没有导致水肿。相反，注射到感染AAV-DTR的Tac1Core小鼠中诱导水肿的快速发展，该水肿被阿瑞匹坦阻断。GTD的酶活性可以通过点突变（D270N，iGTD）失活。iGTD–ciDT融合的管理在感染AAV-DTR的Tac1^cre小鼠中，蛋白质不会诱导水肿。

 

腹腔注射TcdB可以导致老鼠死亡。相比之下，注射GTD–ciDT并不影响生存能力，可能是因为GTD–ciDT仅靶向TAC1+细胞。这使能够在感染AAV-DTR的Tac1^cre小鼠中全身施用GTD–ciDT，这在3h内引起腹泻。组织病理学分析显示结肠组织中存在严重水肿以及轻度中性粒细胞浸润和上皮破坏。相比之下，对未感染AAV-DTR的对照小鼠施用GTD–ciDT，或对感染AAV-DT的Tac1^cre小鼠施用无活性iGTD–ciDT，均未导致任何腹泻或结肠组织损伤。这些发现表明，仅将GTD结构域靶向递送到外周TAC1+神经元中就足以复制与CDI相关的主要组织病理学变化，靶向外源性感觉神经元足以引发结肠中的神经源性炎症，并概括了CDI发病机制的主要因素。

 

6、阻断炎症减少艰难梭菌定植

 

最近的研究表明，毒素诱导的炎症促进艰难梭菌的定植。一致地，尽管在WT和Tac1 KO小鼠之间，感染第一天的艰难梭菌负荷（基于菌落形成单位（C.f.u.）测量）处于相似水平，但Tac1-KO小鼠在第二天显示出艰难梭菌负荷大大降低 。这种减少的病原体载量与在感染缺乏TcdA和TcdB的变异艰难梭菌的WT和Tac1-KO小鼠中观察到的水平相似。同样，在Calcb KO小鼠与WT小鼠中的比较艰难梭菌的负担在第2天也有所减轻。

 

据报道，毒素介导的炎症抑制微生物组多样性的恢复，从而维持一个有利于CDI的非常规状态。一致地，通过16S核糖体RNA基因测序的Fisherα 多样性指数来反映微生物组群落多样性，WT老鼠处于CDI时的1-2天被抑制。相比之下，微生物组多样性第2天开始增加。因此，损耗炎性神经肽的释放不仅直接减少了CDI期间对结肠组织的损伤，还减少了艰难梭菌的定植并促进了微生物组多样性的恢复。

 

7、SP或CGRP阻断可减轻感染

 

SP信号可以使用阿瑞匹坦阻断，阿瑞匹坦是美国食品药品监督管理局批准的治疗恶心和呕吐的药物。CGRP信号传导可以用小分子CGRP受体拮抗剂（如奥西泮）或美国食品药品监督管理局批准的结合CGRP的单克隆抗体（如用于治疗偏头痛的氟曼珠单抗）抑制。在用TcdB进行的盲肠注射试验和使用艰难梭菌630Δerm的CDI小鼠模型中，施用阿匹瑞坦、奥西泮或氟曼珠单抗降低了组织病理学评分。在患有CDI的小鼠中，阿匹瑞坦和奥西泮都降低了第二天的病原体负荷 感染后。药物均未影响艰难梭菌的体外生长速率，也未分别对Tac1小鼠或Calcb KO小鼠产生影响，这表明CDI中病原体定植减少并非由于对艰难梭菌的直接影响。

 

治疗CDI的一个主要挑战是出现高病毒菌株，如核糖型 027。这些菌株通常编码TcdB的一个主要变体，分类为TcdB2，其与艰难梭菌630Δerm中的标准TcdB相比包含约8%的序列变异，并且不与FZD1/2/7结合。将TcdB2注射到小鼠脚垫中诱导水肿，这可以通过阿瑞匹坦或奥西泮预防，这表明TcdB2也诱导神经源性炎症。该作用独立于CSPG4，因为TcdB2在CSPG4 KO小鼠中诱导脚垫水肿。此外，在脚垫注射试验中，TcdA也诱导水肿，这被阿瑞匹坦阻断。与单药治疗相比，阿普匹他和奥司琼或阿普匹特和氟曼珠单抗的联合治疗没有显示出相加作用。

 

本研究确定TcdB通过靶向小鼠模型中的肠道神经支配肽能神经元和周细胞来诱导神经源性炎症。TcdB的特异性由其在ENS和DRG神经元中富集的受体FZD1/2/7和作为周细胞标志物的CSPG4介导。TcdB2和TcdA共同具有诱导神经源性炎症的能力，这表明神经源性发炎在CDI中的核心作用。并发现发现用药物靶向神经源性炎症阻断SP和CGRP是一种有效的、以宿主为导向的治疗方法CDI小鼠模型中的方法。这些药物已经证明在其他临床环境中安全有效。需要进行临床试验来确定这些药物是否对治疗有疗效人类CDI。

 

参考文献

https://doi.org/10.1038/s41586-023-06607-2