2024年1月12日，上海交通大学医学院附属第九人民医院何悦主任和张建军研究员团队在Cancer Immunology Research（IF:10.1）在线发表了题为“Tumor-Derived RAB21+ABHD12+ sEVs Drive the Premetastatic Microenvironment in the Lung”的研究论文。该研究表明，来自HNSCC细胞的RAB21+ABHD12+ sEVs有助于在转移前生态位中免疫抑制微环境的形成。欧易生物提供转录组测序技术服务。

发表期刊：Cancer Immunology Research

影响因子：10.1

研究材料：THP-1ABHD12-OE和THP-1NC细胞诱导的巨噬细胞

研究方法：转录组测序

 

 

研究背景

 

 

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是头颈部最常见的恶性肿瘤，全球每年约有60万例新发病例报告，肺是HNSCC患者最常见的远处转移部位。肿瘤转移是一个空间和时间累积过程，主要包括远处组织转移前微环境的准备，而免疫抑制性巨噬细胞的浸润是转移前生态位最显著特征之一。尽管目前抗PD-1治疗已经取得了一定进展，但只有大约15%至20%的患者从中获益。因此，了解肺转移起始和进展的潜在分子机制对于建立更合适的治疗策略至关重要。

 

研究结果

 

1. HNSCC来源的sEVs被巨噬细胞吞噬

 

已知小细胞外囊泡（sEV）通过运输和递送丰富的生物活性分子参与细胞间通讯。因此，作者首先评估了HNSCC来源的sEV在促进肺转移前生态位形成中的作用。从小鼠HNSCC细胞系分离sEVsEpCAM-GFP并注射到小鼠体内，观察24小时。质谱分析显示，注射sEVs后，小鼠肺中分离的外源sEVsEpCAM-GFP中的蛋白质存在差异表达。注射后24小时，巨噬细胞的百分比显著增加，而CD8+、CD4+和调节性T细胞的百分比没有显著变化。之后，作者通过将生理盐水(对照)、SCC7来源的sEVs (sEVsSCC7)和正常上皮来源的sEVs (sEVsNormal)注射到尾静脉，并结合流式细胞术、透射电镜验证了巨噬细胞的增加是由于局部肺巨噬细胞增殖，并且仅限于肿瘤来源的sEVs；通过蛋白芯片分析和纳米颗粒跟踪分析等方法研究了sEVs的形态和表面标志物，最后通过共孵育实验发现肿瘤来源的sEVs被巨噬细胞内化。这些结果表明，肿瘤来源的sEVs可能在巨噬细胞中发挥重要作用，参与肺转移前生态位的形成。

 

图1 HNSCC衍生的sEV被巨噬细胞吸收

 

2. HNSCC来源的sEV通过RAB21/ integrin-β1进入肺巨噬细胞

 

根据以往文章报道，已知sEVs靶向具有高度血管化的组织，比如肺，这主要取决于它们的表面整合素蛋白。RAB21是Rab蛋白家族中的一员，参与细胞内吞途径，有文献报道内源性integrin-β1与RAB21存在共定位互作。因此，作者研究了sEVs上的RAB21和巨噬细胞上的integrinβ1之间的相互作用，介导HNSCC来源的sEV被肺巨噬细胞的内化过程。通过一系列实验，发现RAB21与integrin-β1存在直接结合关系，且integrin-β1在巨噬细胞中的表达显著高于肺上皮细胞系。为了进一步验证这一结果，作者将不同处理的sEVs注射到小鼠体内，发现sEVsRAB21-OE能增强巨噬细胞中EpCAM-GFP信号，而sEVsRAB21-KD、anti-ITGβ1或anti-RAB21处理的小鼠巨噬细胞中EpCAM-GFP信号减弱。此外，作者还发现sEVs通过重塑转移前生态位促进器官特异性转移行为，并使用实验验证了sEVs对靶器官功能状态的影响。这些数据表明，sEVsRAB21与巨噬细胞上的integrin-β1相互作用，使HNSCC来源的sEVs能够归巢到肺巨噬细胞，并准备好转移前生态位，以促进转移。

 

图2 HNSCC衍生的sEV靶向巨噬细胞

 

3. ABHD12与巨噬细胞共定位并促进HNSCC的恶化

 

通过免疫荧光染色，作者发现ABHD12信号主要定位于巨噬细胞，表明肺转移瘤中巨噬细胞与ABHD12具有相关性。在HNSCC组织中，ABHD12的表达高于正常口腔上皮组织或转移淋巴结组织，且肺转移瘤中ABHD12的表达最高。PCR检测也显示，与正常口腔黏膜样本相比，ABHD12在HNSCC中的表达显著增加，并于患者的不良预后密切相关。同样，TCGA数据分析进一步证实了ABHD12在HNSCC中的高表达。根据TIMER2.0分析，巨噬细胞中ABHD12的表达与M2型巨噬细胞浸润呈正相关。这些结果表明ABHD12可能在肺转移中发挥关键作用。

 

图3 ABHD12与巨噬细胞相关并促进HNSCC恶性肿瘤

 

4. HNSCC来源的sEVs通过ABHD12调节巨噬细胞介导的免疫抑制

 

我们发现，在HNSCC患者肺转移瘤中，ABHD12表达上调与TAMs相关。因此，作者探索了HNSCC来源的sEVs中的ABHD12对巨噬细胞功能的影响。实验结果显示，与正常对照细胞培养基相比，HNSCC细胞共培养体系中M2型巨噬细胞比例增加，而在HNSCCABHD12-KD细胞共培养体系中M2型巨噬细胞比例下降，表明sEV携带的ABHD12可诱导巨噬细胞呈现恶性表型。此外，sEVsHNSCC导致M2型巨噬细胞比例高于正常M2型巨噬细胞，而sEVsABHD12-KD减少M2型巨噬细胞。这些数据表明，高表达ABHD12的sEV可将巨噬细胞转化为恶性表型，并促进转移前生态位的形成。

 

 

图4 HNSCC细胞来源的sEV中ABHD12对巨噬细胞功能的影响

 

5. HNSCC 来源的 sEV 中的 ABHD12 通过驱动转移前生态位的形成来促进肺转移

 

为了进一步评估 sEVsABHD12 在促进 HNSCC 肺转移中的作用，将 SCC7 来源的 sEV（sEVsNC、sEVsABHD12-KD、sEVsABHD12-OE 和 sEVsRAB21-KD）每3天注射到小鼠体内，结果显示sEVsABHD12-OE组小鼠体重显著下降，增强肿瘤肺转移，增加M2巨噬细胞数量和巨噬细胞PD-L1表达，加速CD8+T细胞的耗竭。此外，研究还发现，活化的CD8+T细胞在sEVsABHD12-OE组中受到抑制。这些发现表明，HNSCC来源的sEV中的ABHD12通过重塑转移前生态位来促进肺转移。

 

图5 HNSCC衍生的sEV中的ABHD12通过驱动免疫抑制微环境促进肺转移

 

6. ABHD12通过FoxO1途径调节TAMs的功能

 

对THP-1ABHD12-OE和THP-1NC细胞诱导的巨噬细胞进行RNA测序，差异分析结果显示，包括S1PR1在内的766个差异基因参与了ABHD12对巨噬细胞的调控，为了确定ABHD12调节S1PR1表达的信号通路，进行了KEGG通路富集分析， FoxO信号通路显著富集并且与S1PR1相关。此外作者观察到，在ABHD12过表达的巨噬细胞（巨噬细胞ABHD12-OE）中，FoxO1定位于细胞核，而ABHD12敲低的巨噬细胞（巨噬细胞ABHD12-KD）则显示FoxO1的核输出，而这种效应又依赖于AKT，为了评估 ABHD12-AKT-FoxO1 轴在此过程中的作用，用 AKT 抑制剂和激动剂处理巨噬细胞，结果表明，ABHD12通过调节AKT-FoxO1通路来调节S1PR1的表达，从而影响巨噬细胞的免疫抑制极化。此外，研究还发现，AKT-FoxO1通路是ABHD12诱导的巨噬细胞免疫抑制极化所必需的。

 

图6 ABHD12通过FoxO1途径上调TAM中的S1PR1

 

7. 靶向S1PR1可能增强抗PD-1治疗的抗肿瘤效果

 

为了探讨sEVsABHD12在免疫治疗中的作用，将抗PD-1抗体FTY720、sEVsABHD12-KD和sEVsRAB21-KD注射到sEVsSCC7小鼠体内。3周后，通过尾静脉注射1x106个SCC7GFP细胞，发现FTY720和抗PD-1抗体具有显著的抗肿瘤效果，且联合治疗的效果更佳。同时，当敲除sEV中的RAB21和ABHD12时，抗PD-1治疗的HNSCC肺转移减少。此外，实验还发现FTY720和抗PD-1治疗可以减少M2巨噬细胞浸润，增加CD8+T细胞数量，并减少PD-L1的表达。这些结果表明，S1PR1是提高抗PD-1抗肿瘤疗效的潜在治疗靶点。

 

图7 抗S1PR1增强抗PD-1疗法的抗肿瘤功效

 

研究结论

 

本研究发现携带RAB21的小细胞外囊泡(sEV)可归巢到肺巨噬细胞，并与巨噬细胞上的integrin-β1相互作用。ABHD12在肺转移瘤中高表达，主要在巨噬细胞中高表达。头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)来源的sEV携带ABHD12诱导巨噬细胞向M2免疫抑制表型分化，驱动转移前生态位形成，促进肺转移。ABHD12通过激活巨噬细胞中的AKT-FoxO1通路上调S1PR1，并且在同时靶向S1PR1和PD-1的药物治疗的肿瘤模型中观察到显著增强的抗肿瘤反应。总之，来自HNSCC细胞的RAB21+ABHD12+ sEVs有助于塑造转移前生态位，是增强抗PD-1治疗抗肿瘤疗效的潜在治疗靶点。

 

作者简介

 

上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颌面-头颈肿瘤科何悦主任为文章通讯作者，张建军研究员和郭海艳副主任为文章的共同通讯作者，博士后吴坤为文章第一作者，李岩、纪弈康及刘纯为文章的并列第一作者。并同时致谢上海欧易生物祖启东提供测序数据分析支持。