前言

2022年12月8日，中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所（国家热带病研究中心）沈玉娟研究员和曹建平研究员团队于Frontiers in Immunology（IF:8.786）在线发表了关于单细胞测序揭示囊型包虫病不同阶段内皮细胞和免疫细胞异质性的研究成果，作者对囊型包虫病肝脏微环境的全面探索和首次发现的具有感染期特异性的SPP1巨噬细胞，为血管生成和与感染晚期相关的免疫逃避机制提供了更深入的见解。

期刊：Frontiers in Immunology

影响因子：8.786

发表年月：2022-12-08

材料：小鼠-肝脏

方法：10xGenomics单细胞3端测序
 

研究背景

囊型包虫病（CE）是一种由细粒棘球绦虫幼虫—棘球蚴感染引起的严重慢性疾病，表现为寄生的器官（主要是肝脏和肺部）中的包囊充满了囊液和原头节（PSCs）。宿主产生极其异质的免疫细胞以浸润病变，在不同的感染阶段，这些细胞的数量、组成和功能状态是动态的。目前，scRNA-Seq揭示了人体CE病变微环境中浸润免疫细胞的转录异质性，分析了靶向病变微环境的某些细胞类型，可作为诊断和治疗靶细胞的潜力。然而，不同感染期的具体的免疫机制尚未阐明。
 

研究结果

Result1 小鼠感染后肝脏scRNA序列分析

作者发现，细粒棘球蚴感染后一个月开始形成包囊，并且随着时间的推移更加明显（图1B），说明感染部位的免疫微环境发生了变化。质控后，共采集了45199个细胞，降维聚类后获得8个Cluster，包括B细胞、T细胞、NK细胞、内皮细胞和髓系细胞（图1D）。研究结果表明，寄生虫感染改变了肝脏免疫浸润的特征，不同感染期具有特定的生态系统。

图1

Result2 感染晚期淋巴细胞群的动态变化和B细胞的扩增

为描绘不同感染时期淋巴细胞的变化，作者将NK/T细胞重新聚类获得13个亚群，其中包括：NK细胞、三种CD4T细胞亚型、两种CD8T细胞子型和γδT细胞（图2A）。

细胞毒性T细胞在感染后6个月进行了扩增（图2C），这意味着CD8+细胞毒性T在这一时期对宿主抗细粒棘球绦虫免疫反应。与其他样本相比，NK细胞在感染后3个月富集（图2C）。因此作者推测NK细胞在这一时期对清除寄生虫起了重要作用。

重新聚类B细胞显示，亚群集2和亚集群4的比例在不同感染时间显著变化（图2F）。此外，作者在亚集群4中检测到了一个特征性表达谱（图2E），与细粒棘球绦虫感染后期出现免疫抑制以及包囊转移相一致。GO和KEGG富集分析表明，亚集群2在参与免疫系统过程的负调节和免疫球蛋白产生的负调节的基因富集（图2G），亚集群4在促进免疫应答和炎症富集（图2H），表明感染后6个月亚集群2的增加和亚集群4的减少可能共同导致感染后期宿主的免疫抑制微环境。

Result3 各感染阶段内皮细胞功能

内皮细胞基因的表达热图显示，与WT组相比，DCN和IFN激活的内皮细胞标记基因在感染后1个月显著上调（图2I）。Fcna和C1q在感染后3个月显著上调。不同感染阶段的差异基因表达表明，内皮细胞在感染晚期过度表达纤维化和血管生成相关基因（图2I）。基因集变异分析（GSVA）显示，移植物抗宿主病和同种异体排斥反应通路在感染早期被激活（图2J）。细胞因子-细胞因子受体相互作用途径在感染后期显著丰富，主要影响肝脏代谢能力。

图2

Result4 免疫抑制巨噬细胞亚群显示感染的时间特异性

作者对髓系细胞类型进行了亚聚类分析共获得18个簇（图3A），包括巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、单核细胞祖细胞以及肥大细胞亚群（图3B）。通过其高基因表达将巨噬细胞鉴定为C1QC巨噬细胞和SPP1巨噬细胞（图3A、C）。

在6个月时检测到受感染小鼠肝脏中SPP1巨噬细胞的扩增（图3D）。基于样本中与M1和M2巨噬细胞相关的基因的表达分析，SPP1巨噬细胞可能更类似于M2巨噬细胞，并具有免疫抑制功能（图3E）。通过差异基因比较发现SPP1巨噬细胞表达血管生成相关基因、纤维化相关基因以及免疫抑制基因（图3F），通过S100a4和Rgcc的高表达推测SPP1+巨噬细胞可能为M2巨噬细胞，同时GSVA表现出较强的免疫抑制、血管生成、纤维化富集和ECM受体相互作用，以及C1QC巨噬细胞中的促炎反应富集(图3G)，ECM受体相互作用可能与棘球绦虫囊肿的形成有关。这些结果与感染中后期发生的血管生成、免疫抑制和纤维化一致。

图3

Result5 转录因子调控识别SPP1巨噬细胞功能的基因调控网络

作者通过SCENIC分析推断了SPP1巨噬细胞调节因子，并辅以转录调节因子（图4A）。

根据调节蛋白特异性评分（RSS），确定了与SPP1巨噬细胞相关的最特异性调节蛋白以及和C1QC巨噬细胞相关最特异性调节蛋白（图4B）。为探讨特异调节蛋白对SPP1巨噬细胞表型和功能的影响，作者对特定基因和下游基因进行维恩分析（图4C），结果表明Cebpe、Runx3、Rora可能在感染后6个月作为调节血管生成免疫抑制和肝组织的核心TFs。

图4

Result6 SPP1巨噬细胞起源的拟时序分析

为确定SPP1巨噬细胞的来源作者对肝样本髓系细胞中的单核细胞和巨噬细胞进行拟时序分析（图5A），发现SPP1和C1QC巨噬细胞来源于单核细胞，最终转化为C1QC细胞的中间细胞。将这些来自不同样本的细胞与轨迹相匹配，6个月样本中的中间细胞数量显著增加。这些发现表明，在6个月样本的免疫微环境中，具有免疫抑制功能的SPP1巨噬细胞没有继续发展成具有促进免疫应答的C1QC细胞，而是停滞在免疫抑制的中间状态（图5B），同时这些发现揭示了单核细胞和巨噬细胞发育过程中的动态基因表达谱（图5C，D）。

图5

Result7 SPP1巨噬细胞亚群作为预测细胞-细胞相互作用网络的核心

为描述感染后肝组织中的细胞间相互作用，基于高分辨率scRNA-Seq数据中的配体受体信号，推断细胞与细胞之间的相互作用。C1QC巨噬细胞和内皮细胞在5个样本中有强烈的外向相互作用，SPP1巨噬细胞在6个月时在感染小鼠肝脏中有最强的外向相互作用(图6A)。

作者发现与淋巴细胞募集相关的配体对在不同样本中有显著差异(图6B)，并且观察到内皮细胞的细胞间信号通讯随着感染时间的延长而增强，表明内皮细胞在血管生成过程中至关重要。值得注意的是，内皮细胞上的血管生成相关受体与SPP1巨噬细胞上的相应受体相互作用密切(图6C)，但SPP1巨噬细胞几乎只在6个月的样本中出现。这表明内皮细胞与SPP1巨噬细胞的相互作用对晚期感染血管生成具有重要意义。

为探究SPP1巨噬细胞在6个月样本中的免疫调节作用，作者分别比较了SPP1和C1QC巨噬细胞配体-受体对与其他免疫细胞相互作用的吸引强度。不仅确定了许多配体-受体对仅存在于SPP1巨噬细胞与其他免疫细胞的相互作用中，而且SPP1巨噬细胞也作用于其他免疫细胞(图6D)，这些特殊的配体-受体对可能与SPP1巨噬细胞与其他免疫细胞相互作用以发挥免疫功能有关。

图6
 

文章总结

鉴于CE的细胞复杂性和动态性，深入了解每种细胞亚型对该疾病的功能贡献将有助于解释CE的致病机制，并开发具有特定靶点的药物。单细胞测序结果描绘了不同细粒棘球绦虫感染时期的免疫细胞和内皮细胞景观，并揭示了SPP1巨噬细胞在感染后期的免疫抑制和血管生成中起重要作用，这可能是CE的潜在治疗靶点。

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