大丽轮枝菌是一种土壤传播的植物真菌病原体，可穿透植物根系，并在木质部定植，导致植物发生黄萎病，降低许多重要经济作物的产量。该病原体在世界范围内均有分布，以微菌核形式在土壤中可存活14年以上，且寄主范围广泛，危害性强。目前关于大丽轮枝菌的众多效应因子如何调节植物免疫仍有许多未知。

2023年1月，西北农林科技大学胡小平团队在Microbiology Spectrum上发表了题为“Verticillium dahliae Effector VdCE11 Contributes to Virulence by Promoting Accumulation and Activity of the Aspartic Protease GhAP1 from Cotton”的研究论文，该研究发现大丽轮枝菌的一种新效应因子VdCE11，它可以与棉花的天冬氨酸蛋白酶（GhAP1）靶向互作，并促进GhAP1的积累，提高其水解酶活性，导致棉花黄萎病易感性增强。

文章思路与结果

1.寻找效应蛋白

通过对 XJ592进行全基因组测序，鉴定到793个分泌蛋白。根据经典的效应因子结构特征分析，选择其中67个作为候选效应因子，并瞬转本氏烟，发现VdCE11会引起烟草叶片细胞死亡（图1-A)。

2.看效应蛋白对植物免疫反应系统中的marker影响？

与转GFP对照相比，转的叶片病程防御相关基因表达量显著升高、HO积累显著升高，说明VdCE11在植物免疫应答的调控中起着重要作用（图1-C、D）。

图1

3.还发现VdCE11通过引发植物免疫反应，使转VdCE11的烟草叶片抵抗其他真菌（灰葡萄孢菌、核盘菌）能力增强（图2）。

图2

4.构建效应蛋白敲除株，检测真菌对植物宿主的毒力反应变化？

为更深入地了解VdCE11的功能，构建大丽轮枝菌ΔVdCE11敲除株，侵染棉花和拟南芥，结果发现，接种ΔVdCE11突变体后，棉花和拟南芥植株的病害症状都比接种野生型XJ592的植株要弱得多。通过回补GFP-tagged VdCE11，大丽轮枝菌毒力恢复，说明VdCE11促进大丽轮枝菌对棉花和拟南芥的毒力效应（图3.A-F）。

而接种大丽轮枝菌ΔVdCE11敲除株的烟草，毒力作用反而减弱，可能与VdCE11会引发烟草免疫反应有关。说明VdCE11对不同宿主植物的毒力作用不同（图3.G-H）。

图3

5.寻找效应蛋白在植物宿主中的靶蛋白?

为了寻找VdCE11的宿主靶点，以VdCE11为诱饵，对感染真菌的棉花根系cDNA文库进行了酵母双杂交（Y2H）筛选，结果筛选到互作蛋白GhAP1，并通过Y2H、CoIP等体内外实验对互作进行了证实（图4）。

图4

6.进一步分析植物中靶蛋白功能？

对在棉花中筛选到的靶蛋白GhAP1进行研究，首先检测了棉花接菌后，不同时间GhAP1的表达谱，发现接菌后24h，GhAP1转录水平显著增加。

构建沉默植株，接种XJ592，与野生型棉花对比观察形态指标、真菌定植量、病程相关基因表达量，发现沉默棉株，对大丽轮枝菌抗性增强，说明GhAP1是棉花对黄萎病抗性的负调控因子（图5）。

图5

7.检测效应蛋白对靶蛋白含量及活性的影响?

通过检测共转VdCE11和GhAP1烟草叶片中的GhAP1含量；以及通过体外酶解实验，发现VdCE11可以促进GhAP1的积累和酶活性（图6）。

图6

总结

VdCE11在宿主-病原体相互作用中的功能机制预测模型

本研究鉴定到了一种大丽轮枝菌效应因子VdCE11，它可以诱导本氏烟草的细胞死亡和防御反应。在棉花、拟南芥中，VdCE11促进大丽轮枝菌对宿主的毒力作用。同时，通过酵母双杂交筛选，找到了其在陆地棉中的靶蛋白GhAP1。发现VdCE11可促进GhAP1蛋白的积累，提高其水解酶活性，揭示了大丽轮枝菌毒力效应的作用新机制，为认识黄萎病提供了有价值的数据模型。

DOI: 10.1128/spectrum.03547-22

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