2023年1月12日，复旦大学附属肿瘤医院陆雪官、苏锋涛、嵇庆海教授团队在Cancer Immunology Research（IF:12.020）在线发表了题为“CD161 characterizes an inflamed subset of cytotoxic T lymphocytes associated with prolonged survival in human papillomavirus-driven oropharyngeal cancer”的研究论文。该研究不仅提供了对人乳头瘤病毒驱动的口咽癌免疫景观的深入了解，而且还阐明了具有预后和治疗意义的特殊细胞毒性 T 淋巴细胞。

期刊：Cancer Immunology Research

影响因子：12.020

发表年月：2023年1月12日

方法：10x Genomics单细胞3端测序

研究背景

高危人乳头瘤病毒 (HPV) 的持续感染是导致头颈部鳞状细胞癌 (HNSCC) 恶性转化的主要病因。口咽鳞状细胞癌 (OPSCC) 的发病率在过去十年中迅速增加，并已成为西方国家中最普遍的 HPV 驱动的 HNSCC。尽管出现在相似的解剖位置，但病毒驱动的 OPSCC 与烟草或酒精相关的 OPSCC 不同，并且具有独特的生物学行为和临床表现。

尽管对 HPV 感染驱动的肿瘤内广泛的 T 细胞反应库进行了大量探索，但亚群异质性的深层表型和功能研究的缺乏仍然突出表明迫切需要全面了解 HPV 驱动的 OPSCC 的免疫景观，这将有助于优先考虑哪些分子或细胞类型作为治疗靶点。

研究结果

Result1 HPV 阳性 OPSCC 的单细胞表型

作者通过对HPV阴性和阳性患者的OPSCC肿瘤进行单细胞转录组学分析，发现与 HPV 阴性患者的同质cluster 0 不同，HPV 阳性 OPSCC 的 CTL 显示出异质性增加，并且可以进一步细分为cluster 2、3、9（图 1A 和 C）。在 HPV 阳性患者的 CTL 中发现了总共 50 个下调和 124 个上调的差异基因，top 5 GO biological processes表明 HPV 驱动的 OPSCC 中干扰素相关的免疫反应上调（图 1E）。细胞间通讯网络分析还表明，来自cluster 2、3、9 的 CTL 与癌细胞cluster和其他 T 细胞cluster的相互作用更紧密（图1F）。作者由此提出HPV 的持续感染影响细胞浸润和转录特征，随后导致不同的免疫反应。

图1

Result2 HPV 感染重塑 T 细胞向肿瘤微环境的浸润

鉴于 HPV 阳性 OPSCC 中 CTL 的异质性，作者在cluster 2、3 和 9 之间进行了转录比较以推断主要功能，通过生信分析发现属于cluster 3 的细胞表现出独特的分化轨迹（图 2A），它们过表达与细胞毒性有关的T细胞耗竭标志物（例如 HAVCR2 [Tim-3 基因]、PDCD1 [PD-1 基因]、ENTPD1 [CD39 基因]、CTLA4））与和刺激性细胞因子（例如 GZMB [granzyme B 基因]、IFNG [ IFNγ] 基因）（图 2B）。已有文献报道表达 PD-1/PD-L1 的免疫细胞的 HPV 阳性患者具有理想的临床疗效，此外作者发现 KLRB1 在 CTL 中高表达（图 2H；HPV+ 中 38.5% 的 CTL 与 HPV- 中的 7.7%）并且CTL在cluster 3 中占比最多，其相应的产物 CD161 区分了一个表现出与之一致矛盾特征的亚群。因此作者推测，一部分耗竭型T细胞可能能够发挥强大的抗肿瘤作用。

图2

Result3 CD161+ CTLs 在 HPV 驱动的 OPSCC 患者中非常丰富

接下来作者利用已知数据库（TCGA 数据库、GSE171898 和 GSE113282）比较了HPV阴性和阳性样本中 KLRB1 的转录表达，并验证了 KLRB1 在 HPV 阳性样本中的普遍上调。为了探索 HPV 感染与 CTL 表型之间的关联，作者将HPV 阳性患者的 TIL 或 PBMC 与自体单核细胞共孵育 5 天后，发现暴露于病毒抗原后 CD161+ 比例增加，表明 HPV16 感染对 T 细胞表型的影响。此外，还发现在 HPV 阳性样本中CD8+CD161+ T 细胞比例高于HPV阴性样本（图 3B），并且该亚群在肿瘤中的频率高于外周血（图 3C），这意味着CD161的表达与HPV感染有关。在接受化疗后，在外周血中该细胞亚群同步下降，由此推测CD161 可能成为替代生物标志物。同预期一样，与 HPV 阴性样本相比，HPV 阳性 OPSCC 更密集地被 CD161+ CTL 浸润（图 3E），并且 CD161 的表达与 CD8 的表达显著相关（图 3F）。

图3

Result4 CD161表现出表型和功能上不同的 CTL 亚群

 KLRB1+ CTLs 和 KLRB1- CTLs 经差异分析显示 CXCL13、CTLA4、GZMB、ENTPD1、AKAP5 的表达增加， GZMK、KLRG1 和 JUNB 表达下调（图 4A）。KLRB1+ CTL 亚群和cluster 3 中表达特征的相似性，表明 CD161 可能定义一个具有刺激性和抑制性分子共表达的亚群。数据表明KLRB1+ T 细胞簇中耗竭特征、组织驻留记忆 T 细胞特征和趋化因子/IFNγ 特征的分数相对较高（图 4B）。且在肿瘤或外周血 CD161+ CTL 中证实了TNFα、IFNγ 和granzyme B，以及checkpoint PD-1 和 CD39 表达升高 （图 4C）。尽管这背后的机制仍不清楚，但在某种程度上，与 CD161-CTLs相比，CD161+ 确实区分了具有强烈反应性的炎性T 细胞亚群。

作者发现 CTL 表现出从早期效应状态到功能失调的 T 细胞状态的连续进展。CD161+ CTL 不是处于衰竭的末期，而是更像是一个过渡亚群，因为它们的反应具有可塑性。CD161+ CTL 中immune checkpoints的高表达意味着它们可能成为检查点抑制剂的靶点。因此，作者尝试阻断 PD-1、CD39 和 Tim-3，并评估 CTL 对治疗的反应，PD-1 和 CD39 的抑制增加了 CD161+ CTL 的细胞毒能力（图 4D），而 Tim-3 阻断没有观察到类似效果。在用抗 CD161 阻断 72 小时后，在 CD161+ CTL 中发现 IFNγ 呈升高的趋势（图 4E），表明阻断 LLT1/CD161 轴有较高的抗肿瘤治疗潜力。因此，CD161+ CTLs 高浸润的患者可能表现出更热的肿瘤微环境，并可能优先受益于检查点抑制剂。

图4

Result5 CD161 + CTL 的浸润与较好的治疗反应和延长生存期有关

首先测序队列患者肿瘤标本中评估治疗前CD161+ CTL 的浸润密度，然后根据细胞浸润程度（低，<5%；中等，5-10%；高，>15%）对患者进行分组，结果显示CD161+ CTL表达更高的患者治疗后疗效更好（图5A-D）。随后，作者又在53个样本的验证队列中，进一步验证了这一结论，根据 HPV 状态对患者进行分组，然后按 CTL 的浸润密度排序，结果证实具有更高密度 CD161+ CTL 的患者预后更好，表明治疗前肿瘤内 CD161+ CTLs 的百分比可以作为治疗预测因子，与 HPV 状态无关。

最后，作者在78 名有CD161 受体表达的 OPSCC 患者验证队列中分析了他们的的临床结果。与前人报道一致，CD8+ T 细胞浸润较高的患者具有较高的无进展生存期（PFS） 和总体生存期（OS），但在单独的 CD161+ 中未发现（图 6A）。而CD161+CD8+ CTLs浸润较高的患者具有更高的 PFS 和 OS ，尤其是浸润到上皮细胞中时（图 6B）。所有这些发现都证实了，根据 CTL 上 CD161 的表达可以识别患有免疫学“更热”肿瘤的患者，作为一个可量化的参数，基于CD161 的预后分层可能可以区分哪些患者疗效会更好，并且与 HPV 状态无关。

图5

图6

文章总结

作者阐述了 HPV 阳性 OPSCC 患者的独特免疫学特征，即 CD161 是具有强烈免疫反应的 CTL 亚群的Marker，炎性表型与更好的临床结果相关，可以帮助选择符合条件的患者进行免疫治疗。

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