背景

克罗恩病(CD)是一种炎症性肠病(IBD), 其特征是胃肠道的慢性和复发性炎症，附着在肠壁外部的肥大肠系膜脂肪被称为爬行脂肪(CrF)，它是 CD的独特标志。CrF已被认为在CD的进展中起积极作用，但肠膜脂肪组织(MAT)内的细胞组成及其在CrF形成中的潜在机制尚不清楚。因此这篇文章旨在利用单细胞转录组测序技术（scRNA-seq）来全面构建CrF和MAT的细胞图谱，并阐述了CrF形成过程中细胞成分的功能多样性和动态变化，为基于MAT的治疗的深入研究和潜在靶点提供未来的方向。

作者对来自3对手术切除的CrF和MAT样本的67064个细胞进行了scRNA-seq。在CrF中，首次鉴定出高表达脂蛋白脂酶的特异性血管内皮细胞亚群，并且发现了一种主要存在于CrF中的高表达GREM1和RFLNB新型炎症相关成纤维亚群（F3）。此外，还首次解析了髓系6个巨噬细胞亚群的不同起源和功能。该结果揭示了CD中MAT的细胞异质性以及这些不同的细胞组成在CrF发展中的作用。

结果一

单细胞表达图谱揭示了CD中 MAT的多种细胞类型

为了研究CD中细胞群的异质性以及MAT的分子和通路特征，作者对 CD患者回肠炎症狭窄的3个CrF和相邻的uMAT样本对进行scRNA-seq(图1A)。共获得67 064个高质量单细胞(图1B)。基于典型的marker 基因的表达情况最终鉴定出10种不同的细胞类型(图1D, E)，包括内皮细胞（Ecs）， B细胞，浆细胞，巨噬细胞，上皮细胞，成纤维细胞，平滑肌细胞，中性粒细胞，肥大细胞和t & NK细胞。与uMAT相比，CrF浆细胞明显扩增，而其他细胞类型在两组间无显著差异(图1G和图S2)。这些分析表明，在CD患者中MAT存在复杂的细胞生态系统。由于ECs、成纤维细胞和髓系细胞之前被描述为与CrF的发病机制有关，所以对这些细胞类型的异质性和功能做了进一步的研究。

图1 | 单细胞RNA测序揭示了CrF及其邻近uMAT的细胞异质性

结果二

一种特殊的高表达LPL的VECs亚群可能通过过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路参与CrF的形成

作者将ECs进一步分为5个亚簇(图2A)，其中 4个簇(VEC1-4)标记为血管ECs (VECs)，一个簇标记淋巴管EC (LECs,图2 B)，CrF中VEC2的比例明显高于uMAT（图2C)。热图显示BTNL9、CD300LG、CA4、LPL和FMO2是VEC2中表达量最高的5个基因(图2D), LPL被认为是一种成脂标记物, CrF中LPL+PECAM1+ ECs的比例高于uMAT(图2E)。

GSVA分析显示VEC2主要参与甘油三酯和中性脂分解代谢过程以及对细菌的反应 (图2F)。KEGG分析表明，在VEC2中，PPAR信号转导和脂肪消化吸收得到了强有力的富集(图2G) 。为了进一步研究VEC2在CrF和uMAT之间的功能区别，作者进行了DEGs检测，发现CrF中VEC2金属硫蛋白的表达水平显著升高(图2H)。CrF衍生的VEC2中高表达了三个与脂肪代谢相关的基因，包括FABP4、PLIN2和PLA2G2A (图2H)。结果表明，CrF中的VEC2具有增强的促血管生成和成脂特性。

通过SCENIC分析，PPARγ调节子在VEC2中表现出最高的转录活性(图2I和图S3B)，其仅在内皮细胞中表达(图2J)。在所有血管亚群中，PPARγ在VEC2中的表达最高(图2K和图S3C)，表明其在该亚群的转录调节中的重要作用。富集分析结果表明PPAR信号系统在所有涉及的通路中名列前茅，并且其靶基因多与脂质代谢有关。这些分析结果表明，PPAR信号通路在调节VEC2的功能中是至关重要的，特别是在成脂反应中。

图2 | ECs的亚群分析揭示了一种特殊的VECs亚群

结果三

CrF来源的LECs上调淋巴管生成和炎症反应相关的基因表达和通路

DEGs分析显示CD74是CrF的LECs中上调最多的基因，CD74促进ECs增殖并与管壁的高渗透性相关。FABP5在CrF的LECs中也显著上调，FABP5可在多种细胞类型中表达，并影响细胞增殖和炎症反应。在本研究中还观察到FABP5通过结合FAs激活核内PPAR通路并参与脂质代谢 (图3B)。根据GO分析结果，IFN-γ介导的信号转导和JAK-STAT通路在CrF的LECs中得到增强(图3C)。

通过SCENIC分析，发现CrF中的肌腱膜纤维肉瘤(MAF)调控具有最高的转录强度(图3D)。它干预ECs的凋亡和分化，并对淋巴数量和功能产生潜在影响。通过计算CSI得到了一个由10个模块和37个调控子组成的调控网络(图3E)。模块2中ATF3/JUND异二聚体的转录因子在CrF-LECs中表现出最强的活性(图3F),并与慢性炎症相关。这些分析结果表明CrF衍生的LECs增加了参与炎症反应和淋巴管生成的基因表达，靶向治疗CrF中异常的LECs可能是缓解CD肠道炎症的一种有效的方法。

图3 | LECs基因表达和转录活性的变化

结果四

在CrF中检测到与炎症和纤维化相关的GREM1+RFLNB+炎症相关成纤维细胞的新亚群

对成纤维细胞又分成7个亚簇(FC1-FC7，图4A)， FC3是一个先前未报道的并且高表达 GREM1和RFLNB的亚群 (图4C)，CrF组GREM1+ RFLNB+细胞比例明显高于uMAT组(图4D, E)。基于3种基因标记(CCL2、IL-6和IRF1表S2)，FC3细胞被认为是炎症相关的成纤维细胞(IAFs)。GSVA分析表明，FC3主要参与炎症反应(IgA产生和Th17细胞分化（图4F)和Smad蛋白磷酸化的调节(图4G)。GREM1 + RFLNB + IAFs首先主要在CrF中发现，并在促炎反应和肠纤维化中显示出潜在的能力。

图4 | MAT中的成纤维细胞分为7个亚群

结果五

拟时序分析IAFs在CrF形成过程中的促炎和促纤维化特性

在拟时序分析中2例患者的成纤维细胞经历了相似的3种状态的轨迹路径(图5C, D)。uMAT来源的成纤维细胞主要位于分支前(state1)，而CrF来源的成纤维细胞主要位于state2 (图5E, F)，表明CrF形成过程中存在过渡状态。处于state 3的成纤维细胞表现为中间表型(图5G, H)。GREM1 + RFLNB + IAF亚群的细胞分布与CrF来源的成纤维细胞高度匹配，证实了它们的主要来源是CrF。

基因动力学分析(图5I, J)显示，state2显著上调的基因集中在胶原合成、细胞外基质调控、IL-17和TNF信号通路。state 3以免疫和炎症反应相关基因和NF-κB信号通路表达为特征。此外，与许多纤维化疾病相关的CrF源性成纤维细胞中亚油酸的强大代谢活性也富集在FC3中(图5K, L)。因此，FC3亚群作为主要来自CrF的IAFs，可能在促进炎症和纤维化中起着至关重要的作用。为了进一步揭示成纤维细胞致病行为的潜在机制。SCENIC分析结果显示5个调控信号在CrF来源的成纤维细胞中显示出增强的转录活性(图5M)。REL和NF-κB1作为NF-κB系统的主要成员，在促炎和促纤维化反应中得到了很好的研究，该结果为通过调节成纤维细胞的转录来干预炎症和纤维化行为提供了新的见解。

图5 | 拟时序分析和基因变化探索成纤维细胞的发育轨迹

结果六

CD的MAT中巨噬细胞来源和功能的异质性

共检测到9个髓系簇(图6A)，并鉴定出巨噬细胞，常规树突状细胞和髓样祖细胞(图6 B)三种细胞类型。研究发现巨噬细胞占据了MAT中髓系细胞群体的绝大部分(图6C)。基因热图显示(图6D)，C1是一种抗炎表型（IL-10）；C3（CCL8）呈现促炎特性并且载脂蛋白A1在C3中高表达；C4被定义为单核细胞衍生的巨噬细胞（S100A8、S100A12）；C5/C6(MERTK、GPR34)都被认为是组织中的巨噬细胞；C8（C1Q、SELENOP）是免疫调节相关巨噬细胞群。

GSVA分析(图6E，F)发现，C1富含血清素受体信号转导，血清素调节巨噬细胞的表型和功能极化，维持其抗炎状态。此外，GSEA显示出CrF中巨噬细胞吞噬作用的显著增强(图6G)，这与其防御细菌易位的能力一致。

图6 | CD的MAT中巨噬细胞亚群起源和功能的异质性

结果七

CD中MAT的细胞间通讯

细胞通讯分析结果表明成纤维细胞与其他细胞类型相互作用最广 (图7B, C)，特别是与ECs。成纤维细胞和LECs在CrF中表现出最强烈的相互作用(图7D)，而在uMAT中发现与VECs的交流最强(图7E)。

巨噬细胞作为重要的免疫细胞，在MAT中与其他细胞类型的相互作用最多(图7E)。在CrF中，IL-1β与巨噬细胞上的经典受体IL-1β r联合在成纤维细胞中高表达，可将M2巨噬细胞转化为m1炎性表型，加剧疾病发展(图7G)。CrF中的成纤维细胞和LECs都产生了与巨噬细胞上的受体LRP1结合的MDK(图7G, H)。

MDK-LRP1轴在促进免疫抑制巨噬细胞的分化中起着至关重要的作用，即M2表型，促进CrF的形成和纤维化。该研究揭示了MAT在CD中细胞-细胞通信的多样性，并强调了成纤维细胞、ECs和巨噬细胞在复杂网络中的关键作用。

图7 | CrF和uMAT之间的细胞-细胞通信网络

文章亮点点评

这篇文章通过scRNA-seq来全面构建CrF和MAT的细胞图谱，并阐述了CrF形成过程中细胞成分的功能多样性和动态变化，不仅首次鉴定出高表达脂蛋白脂酶的特异性血管内皮细胞亚群，并且发现了一种主要存在于CrF中的新型炎症相关成纤维亚群，还首次解析了巨噬细胞亚群的不同起源和功能，为基于MAT的治疗的深入研究和潜在靶点提供未来的方向。

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