2023年2月，浙江大学农业与生物技术学院祝水金团队在Molecular Plant杂志（IF=21.949）发表题为“Single-cell transcriptomic analysis reveals the developmental trajectory and transcriptional regulatory networks of pigment glands in ”的研究论文，该研究对色素腺体形态发生的生物学过程以及调控色素腺体性状的分子机制进行了深入探索。赵天伦特聘副研究员和祝水金教授为该论文通讯作者，博士生孙悦和韩一飞为共同第一作者。

研究背景

棉花（. spp）是重要的经济作物，棉籽中含有丰富的油分及蛋白质。色素腺体是棉属特有的防御结构，其主要内含物棉酚在棉花病虫害抗性中起重要作用，但因其对人类和反刍动物的毒性，限制了棉籽资源的利用。比克氏棉（）等澳洲野生棉种具有优良的“子叶色素腺体延缓形成形状”性状，种子无色素腺体低棉酚，有利于充分利用棉籽资源；植株有色素腺体有棉酚，有助于保持植株对病虫害的抗性，具有重要的育种价值。探究色素腺体形态发生的生物学过程及其潜在分子机制，对培育种子无色素腺体而植株有色素腺体的新型低酚栽培棉种至关重要。

研究内容

本研究利用萌发48小时 子叶（色素腺体形态发生的活跃阶段）作为样本制备原生质体，进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)。进而采用无监督聚类将细胞分成14个类群，通过已知细胞marker基因分为8个细胞类型。聚类结果证实色素腺体细胞与其他细胞分离明显，进一步通过细胞亚群分为色素腺体薄壁细胞、分泌细胞和凋亡细胞。结合单细胞表达图谱信息，并整合色素腺体细胞发育轨迹、转录因子调控网络、核心转录因子功能验证，构建出相对完整的色素腺体形态建成模型，并证实光和赤霉素可促进色素腺体的形成。此外，本文挖掘了3个影响色素腺体形成的基因和。这些发现揭示了棉花色素腺体形态发生生物学过程以及调控色素腺体性状的分子机制。

研究路线

研究结果

1.棉花子叶单细胞转录组图谱的构建

生理发育试验研究证实，比克氏棉休眠棉籽无色素腺体无棉酚，直到种子萌发12小时后才检测到棉酚，并在萌发过程中逐渐在子叶中积累。因此为了利用scRNA-seq构建完整的色素腺体发育轨迹，本研究选取萌发48小时的比克氏棉子叶样本。采用scRNA-seq平台对原生质体细胞进行检测，成功获得12222个高质量细胞的转录组数据。进一步通过主成分分析(PCA)和无监督聚类，分离14个不同的细胞类群。根据数据库中报道细胞类型marker鉴定，将14个不同的cluster分为8个细胞群，包括叶肉细胞(MC)、色素腺体细胞(PG)、表皮细胞(EC)、保卫细胞(GC)、木质部细胞(XC)、原形成层细胞(PC)、韧皮部薄壁细胞(PP)和伴细胞(CC)。

为了验证新的细胞标记基因，本文通过RNA原位杂交确定了两个新细胞标记基因： 和，进一步明确了色素腺体细胞类群定义的可靠性。此外，从bulk RNA-seq数据集中获得的表达模式也支持scRNA-seq特异性色素腺体细胞的结论，功能分析证实较多富集通路与感兴趣的细胞相关。

图1 | 棉花子叶单细胞转录组图谱的构建

2.色素腺体细胞的发育轨迹

色素腺体细胞类型与其他细胞类型分离明显，进一步将其分为三个细胞亚群，棉酚生物合成基因在亚型2中高度富集，表明亚型2为分泌细胞，亚型1被确定为色素腺体薄壁细胞，进一步对细胞亚型进行GO分析，证实核糖翻译相关的功能在色素腺体薄壁细胞中富集，与萜类化合物生物合成相关在分泌细胞中富集。由于氧化还原酶活性的富集，线粒体和核糖体基因的低表达，推测亚型3是凋亡前细胞。bulk RNA-seq数据证实了细胞亚型的分配。

为了揭示参与色素腺体发育时空调控的基因，通过拟时序分析进行模块划分。模块a涉及对生物和非生物胁迫的响应，表明色素腺体细胞发育的激活可能依赖于外部刺激。模块d显示出萜类生物合成的特征，与成熟分泌细胞中的棉酚合成一致。模块e涉及DNA构象变化等，是凋亡细胞的典型特征。

图2 | 色素腺体细胞的发育轨迹

3.参与色素腺体形成转录因子调控网络的构建

与色素腺体分化相关的转录因子在色素腺体细胞中被鉴定出来，包括和。从薄壁细胞到分泌细胞的转变受和的调控，而从分泌细胞到凋亡细胞的转变受的调控。为了寻找下游基因，对进行DNA亲和纯化测序(DAP-seq)，将DAP-seq和scRNA-seq进行整合，建立了一个以为枢纽基因的TF网络，获得棉花色素腺体形态建成的工作模型。

为了验证该模型，进而对子叶采用bulk RNA-seq技术，发现相关转录因子表达量在萌发过程中增加。采用病毒诱导基因沉默(VIGS)方法验证8个代表性转录因子的功能，证实沉默的幼苗叶和茎中的色素腺体密度和棉酚含量均显著低于阴性对照的幼苗。结果表明，这些转录因子可能在棉花色素腺体的形成中起重要作用。

图3 | 棉花色素腺体形态建成模式图

图4 | 转录因子在色素腺体发育中的功能验证

4.光和GA参与色素腺体的形成

此外，通过单细胞转录组、bulk转录组数据关联表型分析，结合核心转录因子的启动子鉴定，发现了光和赤霉素影响棉花色素腺体形成，并通过暗、光、赤霉素(GA)和赤霉素抑制剂（多效唑）不同组合处理下的比克氏棉色素腺体的发育情况进行验证。在种子吸收36、48、60、84 h，光照+GA条件的色素腺体密度大于光照条件，显著大于暗+GA条件的色素腺体密度。结果表明，光和GA能够促进色素腺体的形成。进一步比较暗处理和光处理下色素腺体相关转录因子的表达水平，在无光条件下表达水平下调。此外，在黑暗条件下，大多数棉酚生物合成基因的表达水平上调，这表明光可能抑制棉酚的合成。

图5 | 光和GA促进色素腺体发育

研究结论

本文描绘了棉花子叶单细胞转录图谱，利用比克氏棉色素腺体的独特性状和scRNA-seq技术揭示了色素腺体的发育轨迹和转录调控网络。创新性的发现3个影响色素腺体形成的新基因和。这些发现为色素腺体的形态发生提供新见解，并为未来的棉花scRNA-seq研究奠定基础。

推荐语

本文探索了棉花色素腺体发育的生物学过程以及调控形态发生性状的分子机制，首先构建棉花子叶单细胞转录组图谱，其次利用色素腺体细胞发育轨迹、转录因子调控网络、核心转录因子功能验证等方法，揭示了一个相对完整的色素腺体形态建成模型。这篇文章系统阐述了棉花色素腺体形态和生物学过程的重要作用机制，并突出单细胞RNA测序及其拟时序分析的研究价值，十分值得借鉴。

Sun Y, Han YF, Sheng K,. Single-cell transcriptomic analysis reveals the developmental trajectory and transcriptional regulatory networks of pigment glands in[J]. , 2023.


详细技术请访问欧易生物官网
⬇
百度搜索欧易生物（oebiotech）
⬇
了解更多多组学技术


长按扫码
咨询欧易生物技术工程师